(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111154006.0 (22)申请日 2021.09.2 9 (71)申请人 昆明市延安医院 地址 650000 云南省昆明市人民东路245号 (72)发明人 谭晶　李汝红　王文举　黄文文　 段德仁　林杼颖　侯宗柳　孟明耀　 李琳　 (74)专利代理 机构 昆明正原 专利商标代理有限 公司 53100 代理人 于洪　陈左 (51)Int.Cl. C12N 15/85(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 15/62(2006.01) A61K 39/00(2006.01)A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 具有靶向高强度杀瘤活性的Mesothelin嵌 合抗原受体修饰的T细胞的制备方法 (57)摘要 本发明涉及具有靶向高强度杀瘤活性的 Mesothelin嵌合抗原受体修饰的T细胞的制备方 法， 将MSLN ‑CAR‑puro质粒转化进入大肠杆菌感 受态细胞中， 在固体培养基上涂布筛选培养， 长 出的单菌落扩繁后提取质粒； 制备人外周血单核 淋巴细胞PBMC； 将提取的质粒、 Super  PiggyBac   Transposase质粒与电转缓冲液混合， 然后转染 PBMC， 之后使用X ‑VIVO培养基进行培养， 用CD3/ CD28磁珠激活扩增CD3 阳性T细胞， 筛选并扩增转 染后的T细胞。 本发明通过PiggyBac转座子系 统 构建靶向间皮素的MSLN ‑CAR‑T细胞， 对实体肿瘤 具有靶向杀伤性， 安全性好， 为相关的临床转化 提供研究基础。 权利要求书2页 说明书7页 附图4页 CN 114015720 A 2022.02.08 CN 114015720 A 1.具有靶向高强度杀瘤活性的Mesothelin嵌合抗原受体修饰的T细胞的制备方法， 其 特征在于， 包括如下步骤： 步骤一： 将MSLN ‑CAR‑puro质粒转化进入大肠杆菌感受态细胞DH5α 中， 在含有50μg/mL 氨苄青霉素的LB固体培 养基上涂布筛 选培养， 长出的单菌落扩大繁殖后提取质粒； 步骤二： 利用密度梯度离心法制备 人外周血 单核淋巴细胞PBM C； 步骤三： 将步骤一提取的质粒、 Super  PiggyBac  Transposase质粒与电转缓冲液混合， 制得电转混合液， 并用电转混合液转染PBM C细胞， 得到转染后的PBM C细胞； 步骤四： 将转染后的PBMC细胞使用X ‑VIVO培养基进行培养， 用CD3/CD28磁珠激活扩增 CD3阳性T细胞， 用1 μg/mL嘌呤霉素筛选并培养扩增转染后的T细胞， 获得Mesothelin嵌合抗 原受体修饰的T细胞MSL N‑CAR‑T。 2.根据权利 要求1所述的具有靶向高强度杀瘤活性的Mesothelin嵌合抗原受体修饰的 T细胞的制备方法， 其特征在于， 步骤一中， 将MSLN ‑CAR‑puro质粒转化进入大肠杆菌感受态 细胞DH5α 中， 在含有50 μg/mL氨 苄青霉素的LB固体培养基上涂布筛选培养， 长出的单菌落扩 大繁殖的具体方法为： （1.1） 将大肠杆菌感受态细胞DH 5α 从‑80℃下取出并放置 于冰上孵 育5min， 待其融化； （1.2） 将1μL  MSLN‑CAR‑puro质粒加入到装有100μl大肠杆菌感受态细胞DH5α 的1.5mL   EP管中， 混匀后放置于冰上孵育30分钟， 之后于42℃下热激90秒后， 再放置于冰上孵育2分 钟； 接着加入37℃预热的700 μl无氨苄青霉素的LB液体培养基， 混匀后放置于37℃摇床； 待 培养基变浑浊， 则取出2 ‑3 μl摇匀的菌液加入到37℃的LB固体培养基中， 再加入3 ‑5粒灭菌 涂布珠摇匀； 再将固体培 养基倒置， 于 37℃下培 养10‑12小时， 孵化菌群； （1.3） 挑取单菌落加入预热好的5mL含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中； 于37 ℃摇床培养， 待培养基变浑浊之后， 将摇好的菌液全部加入200mL含有50 μg/ml氨苄青霉素 的LB液体培养基中， 于37℃摇床培养； 将培养好的菌液取1 ‑5mL保存菌种后， 剩下的菌液进 行质粒提取。 3.根据权利 要求2所述的具有靶向高强度杀瘤活性的Mesothelin嵌合抗原受体修饰的 T细胞的制备方法， 其特征在于， （1.2） 中， 摇床速度为255转/min， 时间为45分钟； （1.3） 中， 第一次摇床速度为255转/min， 时间为3小时； 第二次摇床速度为每分钟255转/min， 时间为 12‑24小时； 以上摇床均在37摄氏度下工作。 4.根据权利 要求1所述的具有靶向高强度杀瘤活性的Mesothelin嵌合抗原受体修饰的 T细胞的制备 方法， 其特 征在于， 步骤三的具体方法为： （3.1） 将步骤二制得的人外周血单核淋巴细胞PBMC用X ‑VIVO培养基重悬， 调整密度 为1 ×106/mL， 放于37℃， 5%CO2培养箱中孵育2 h， 之后根据每个 反应20×106细胞量分装后离心， 弃上清， 用PBS重悬后收集至 EP管中离心备用； （3.2） 将电转缓冲液冰上融化， 取82 μl  Nucleofector  Solution与18 μl  supplement加 入EP管中， 共计100μl体积， 充分混匀； 接着加入10μg步骤一提取的质粒和5μg  Super  PiggyBac Transposase质粒， 充分 混匀， 制得电转混合液； （3.3） 将电转混合液加入 （3.1中） 到 离心好的PBM C中重悬， 之后进行电转。 5.根据权利 要求4所述的具有靶向高强度杀瘤活性的Mesothelin嵌合抗原受体修饰的 T细胞的制备 方法， 其特 征在于， （3.1） 中， 离心速度均是20 0×g， 时间均是5分钟。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114015720 A 26.根据权利 要求4所述的具有靶向高强度杀瘤活性的Mesothelin嵌合抗原受体修饰的 T细胞的制备方法， 其特征在于， （3.1） 的具体方法为： 将步骤二制得的人外周血单核淋巴细 胞PBMC用X ‑VIVO培养基重悬后37℃孵育2h后， 按每个反应20 ×106/mL计算所需PBMC数， 将 所需总量的PBMC移至50mL离心管， 离心， 弃上清； 离心后每个反应数用1mLPBS重悬， 分装至 1.5mL的EP管中， 离心， 弃 上清。 7.根据权利 要求1所述的具有靶向高强度杀瘤活性的Mesothelin嵌合抗原受体修饰的 T细胞的制备 方法， 其特 征在于， 步骤四的具体方法为： （4.1） 将转染后的细胞加入到于37℃、 5% CO2培养箱中预热好的X ‑VIVO培养基， 之后转至 37℃， 5%CO2培养箱中孵育2h后取出， 若观察到有白色团块出现， 按培养液： DNA酶体积比1： 100加入DNA酶处 理团块至消散； （4.2） 离心， 弃尽培养基， 用X ‑VIVO培养基重悬细胞， 将细胞浓度调整为1 ×106/mL后， 于 37℃、 5%CO2培养箱中孵 育过夜， 离心， 弃 上清， 细胞团块备用； （4.3） 根据磁珠： 细 胞=2:1的数量计算所需磁珠数， 取相应体积 混匀的磁珠加入新的离 心管中， 加 入X‑VIVO培养基洗涤两次， 去除上清， 然后加 入新鲜X‑VIVO培养基， 培养基的量 按每1×106细胞1mL计算， 向磁珠、 培养基混悬液中加入IL ‑2、 IL‑21， 至IL ‑2终浓度为 300IU/mL、 I L‑21终浓度为3 0ng/mL， 得到混合液； （4.4） 将 （4.3） 得到的混合液加入到 （4.2） 离心后的细胞中， 混匀后移至6孔板于37℃， 5%CO2培养箱中培养， 5d后， 去除磁珠， 之后加入含有300IU/mL  IL‑2、 30ng/mL  IL21的X‑ VIVO培养基重悬细胞， 混匀后于37℃， 5%CO2培养箱中继续培养观察， 之后进行嘌呤霉素筛 选及扩增。 8.根据权利 要求7所述的具有靶向高强度杀瘤活性的Mesothelin嵌合抗原受体修饰的 T细胞的制备 方法， 其特 征在于， （4.2） 、 （4.4） 中， 离心速度是20 0×g， 时间是5分钟。 9.权利要求1~8任意一项所述的具有靶向高强度杀瘤活性的Mesothelin嵌合抗原受体 修饰的T细胞的制备 方法制得的Mesothel in嵌合抗原受体修饰的T细胞。 10.权利要求9任意一项所述的具有靶向高强度杀瘤活性的Mesothelin嵌合抗原受体 修饰的T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114015720 A 3