(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111135256.X (22)申请日 2021.09.27 (71)申请人 中国人民解 放军陆军 军医大学 地址 400038 重庆市沙坪坝区高滩岩正 街 30号 (72)发明人 凌开建　梁志清　张建祥　窦寅　 王延洲　 (74)专利代理 机构 北京同恒源知识产权代理有 限公司 1 1275 代理人 赵荣之 (51)Int.Cl. A61K 48/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 37/04(2006.01) A61K 35/17(2015.01)B82Y 5/00(2011.01) (54)发明名称 淋巴细胞和介导CRISPR系统的纳米复合物 联合在制备治 疗宫颈癌药物中的应用 (57)摘要 本发明涉及淋巴细胞联合介导CRISPR系统 的基因编辑纳米复合物在制备宫颈癌治疗药物 中的应用， 属于医药技术领域。 本发明采取Cas9   mRNA和向导RNA同时递送策略， 成功构建了具有 较好转染效能的CRISPR/Cas9纳米递送系统， 为 非病毒载体的研发提供了一种新的尝试， 并且所 构建的pH响应性环糊精纳米复合物存在的低pH 值靶向特性及内生逃逸机制， 有利于其在肿瘤局 部释放纳米颗粒， 最大效能发挥体内运输作用。 同时， 因宫颈癌的免疫抑制微环境复杂， 淋巴细 胞联合基因编辑纳米复合物进行宫颈癌的治疗， 两者的联合应用可在肿瘤局部重塑局部免疫环 境， 最大限度发挥抗肿瘤作用。 权利要求书1页 说明书6页 附图5页 CN 113952475 A 2022.01.21 CN 113952475 A 1.淋巴细胞和介导CRISPR/Cas9基因编辑系统的纳米复合物联合在制备宫颈癌治疗药 物中的应用。 2.如权利 要求1所述的应用， 其特征在于， 所述介导CRISPR系统的纳米复合物包含根据 宫颈癌靶标基因设计的向导RNA、 Cas9的mRNA和缩醛化β ‑环糊精。 3.如权利 要求2所述的应用， 其特征在于， 所述介导CRISPR系统的pH响应性环糊精纳米 复合物的构建方法为： A、 根据宫颈癌靶标基因， 设计向导RNA序列， 合成Cas9的mRNA和向导RNA； B、 将Cas9的mRNA和向导RNA混合得到内水相， 加入有机相溶液中混合均匀， 形成油包水 初乳， 所述有机相溶 液中包括枝化聚乙烯亚胺和缩醛化β ‑环糊精； C、 再向油包水初乳中加入聚乙烯醇溶液， 混合后得到水包油包水复乳， 搅拌挥发有机 溶剂后， 经 过固化、 高速 离心、 洗涤， 得到pH响应性环糊精纳米复合物。 4.如权利要求3所述的应用， 其特征在于， 步骤B中， 所述缩醛化β ‑环糊精的制备方法 为， 将二乙氧基丙烯和对甲苯磺酸吡啶盐加入β ‑环糊精溶液中， 搅拌溶解后， 再加入甲氧 基丙烯， 反应小时， 再向反应液中加入三乙胺， 终止反应， 加水沉淀， 离心， 水洗至溶液变清， 真空干燥， 得到缩醛化β ‑环糊精。 5.如权利要求3所述的应用， 其特征在于， 所述二乙氧基丙烯、 对甲苯磺酸吡啶盐、 β ‑环 糊精、 甲氧基丙烯和三乙胺的质量体积比为 4.5： 16.3： 1： 4： 0.5， mL： mg： g： mL： mL。 6.如权利要求3所述的应用， 其特征在于， 步骤B具体为， 将Cas9的mRNA和向导RNA混合 得到内水相， 缩醛化β ‑环糊精和枝化聚乙烯亚胺混合得到有机相； 将有机相和内水相缓慢 混合， 在磁力搅拌的同时， 有机相以1mL/min的速度缓慢 滴入到内水相中， 超声， 形成油包 水 初乳。 7.如权利要求3所述的应用， 其特征在于， 步骤B中， 所述有机相中枝化聚乙烯亚胺和缩 醛化β‑环糊精的质量比为1:6 。 8.如权利要求3所述的应用， 其特征在于， 步骤C具体为， 向油包水初乳中加入聚乙烯醇 溶液， 超声混合后得到水包油包 水复乳， 磁力搅拌下3小时， 室温下静置至固化， 26000rpm高 速离心， 去离子水洗涤4 ‑5次， 得到pH响应性环糊精纳米复合物， 所述聚乙烯醇溶液的浓度 为1％。 9.如权利要求1～9任一项所述的应用， 其特征在于， 所述宫颈癌靶标基因为宫颈癌E6 和E7基因。 10.如权利要求1～9任一项所述的应用， 其特征在于， 所述淋巴细胞来源于低免疫原性 的脐血淋巴细胞， 在CRISPR系统的纳米复合物应用后， 再联合淋巴细胞的免疫治疗， 可提高 肿瘤局部T细胞浸润， 协同抗肿瘤。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 113952475 A 2淋巴细胞和介导CRI SPR系统的纳米复合物联合在制备治疗宫 颈癌药物中的应用 技术领域 [0001]本发明属于医药技术领域， 具体涉及淋巴细胞联合介导CRISPR/Case9纳米基因编 辑系统在制备治疗宫颈癌药物中的应用。 背景技术 [0002]宫颈癌筛查技术在我国推行多年， 国家层面也推行行了免费普查等措施， 但中国 宫颈癌近几年每年的新 发病例仍近11万， 死亡病例近6万， 分别约占全球发病和死亡总数的 18.3％和17.6％， 我国宫颈癌患者约占全球的1/5， 防控的压力很大。 人乳头状瘤病毒(HPV) 是该病发生的最主要危险因素和致病元凶。 局部晚期宫颈癌复发率较高， 晚期生存率堪忧 。 晚期复发转移及持续宫颈癌存在放化疗耐受， 生存期短， 无有效的治疗措施。 免疫及基因治 疗为患者带来新的希望。 宫颈癌局部免疫微环境复杂， 众多因素参与其中。 重塑宫颈癌局部 免疫微环境 也是未来研究的热点。 [0003]HPV作为外源性病毒DNA， 可整合到宿主DNA。 众所周知， 促进宫颈癌发生发展的致 病基因主要是E6/E7。 研 究表明敲除致病基因E6/E7后肿 瘤细胞出现凋亡， 此为宫颈癌的基 因治疗提供了支撑。 针对HPV的基因治疗不损害 人体正常基因， 在最大限度减少脱靶率的前 提下， 宫颈癌的基因治疗具有广阔的前景。 作为有效荷载CRISPR/Cas9系统的运送工具， 载 体分为病毒和非病毒两大类。 病毒基因的融合可能会破坏人体重要基因的表达。 鉴于病毒 载体存在安全性、 免疫原性及潜在的致瘤性风险， 非病毒载导的临床应用亟待兴起。 目前， 非病毒性递送方法及载体材料成为研究热点， 但该方法递送及优化仍有待深入研究。 我校 成功研发了pH响应性环糊精纳米材料， 拥有专利技术。 既往研究显示该纳米粒通过优化制 备， 在药物递送体内实验中显示了良好的缓释及靶向作用， 并具有良好的组织相容性。 此 外， 前期合作团队应用纳米粒递送CRISPR/Cas9基因编辑复合物， 实验证明可在低氧低pH值 的组织和细胞内靶向降解释放， 并具有高效的转 染率、 稳定和 低毒等特性。 在宫颈癌中可有 效靶向敲除E6/E7基因， 并具有较强的抗肿 瘤活性。 鉴于pH响应性环糊 精纳米的性能优势， 我们对应用该材料载导CRISPR/Cas9系统产生了兴趣， 采用mRNA同步递送策略， 最大限度减 少脱靶及使用的便利性。 [0004]此外， 尽管应用CRISPR/Cas9基因编辑的新型纳米复合物可有效靶 向敲除肿瘤的 致癌基因， 消减肿瘤癌蛋白的作用， 从而遏制肿瘤生物学恶性行为； 但单一的靶向敲除技术 可存在不具备持久性， 加之肿瘤的异质性以及此消彼长及 免疫逃逸机制， 不能最大限度达 到消灭肿瘤的目的。 因此， 基因治疗联合其他治疗方法可作为新的策略。 宫颈癌免疫治疗为 晚期复发转移宫颈癌提供了契机， 但PD1， CTLA ‑4等免疫治疗反应率不足30％。 如何重塑免 疫微环境是临床 研究的方向。 目前， CAR ‑T治疗， 自身淋巴细胞过继治疗， 联合 或不联合放化 疗等治疗策略也在不断探索中。 [0005]如何让T淋巴细胞迁移至肿瘤组织， 如何有效激活CD8+T细胞， 是重塑肿瘤免疫微 环境的重要环节。 基于前期采用pH响应性环糊精同时递送CRISPR/Cas9  mRNA， 特异靶向敲说　明　书 1/6 页 3 CN 113952475 A 3