(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111233544.9 (22)申请日 2021.10.2 2 (71)申请人 上海交通大 学 地址 200240 上海市闵行区东川路80 0号 (72)发明人 蔡宇伽　 (74)专利代理 机构 上海汉声知识产权代理有限 公司 3123 6 代理人 胡晶 (51)Int.Cl. A61K 35/763(2015.01) A61K 39/395(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C12N 7/01(2006.01) C12N 15/63(2006.01) A61K 31/502(2006.01) (54)发明名称 溶瘤病毒、 PARP抑制剂及PD-1抗体在制备抗 肿瘤药物中的应用 (57)摘要 本发明提供一种溶瘤病毒、 PARP抑制剂及 PD‑1抗体在制备抗肿瘤药物中的应用， 通过在I 型单纯疱疹病毒中插入miRT124和hGMCSF， 获得 溶瘤病毒oHSV， 使溶瘤病毒的安全性提高的同时 增强机体免疫反应； 通过溶瘤病毒oHSV和 Olaparib联合使用， 发现二者联用能够使CD4+T 细胞和CD8+T细胞的PD ‑1表达量增加， 从而引入 免疫检查点抑制剂， 即PD ‑1抗体， 使治疗方案在 乳腺癌中的疗效进一步提升， 进一步通过oHSV、 Olaparib 与PD‑1抗体联合使用， 抑制小鼠乳腺癌 原位肿瘤的大小， 前两者联合使用的基础上， 进 一步减少肺部转移灶的数量， 显著延长小鼠的生 存期。 权利要求书2页 说明书7页 序列表3页 附图4页 CN 114010666 A 2022.02.08 CN 114010666 A 1.一种抗肿瘤药物 组合物， 其特征在于： 包括溶瘤病 毒和PARP抑制剂， 所述溶瘤病 毒选 自I型单纯疱疹病毒， 所述PARP抑制剂为 Olaparib， 所述 Olaparib的分子式为C24H23FN4O3； 所 述Olaparib的结构式所如式Ι 示： 2.根据权利要求1所述抗肿瘤药物组合物， 其特征在于： 所述溶瘤病毒为在I型单纯疱 疹病毒中插 入miRT124和hGM CSF制备而得。 3.根据权利要求1所述抗肿瘤药物组合物， 其特征在于： 所述溶瘤病毒的用量为10 × 107‑100×107PFU、 所述Olaparib的用量 为100‑1000mg/kg。 4.根据权利要求1所述 抗肿瘤药物组合物， 其特 征在于： 所述组合物还 包括PD‑1抗体。 5.根据权利要求4所述抗肿瘤药物组合物， 其特征在于： 所述PD ‑1抗体的用量为450 μg ‑ 750 μg。 6.根据权利要求1中任一项所述抗肿瘤药物 组合物， 其特征在于： 所述溶瘤病 毒通过包 括如下步骤的方法制备获得： S1.分别扩增HSV ‑1、 ICP34.5基因的两端序列； S2.使用同源重组的方法， 将hGM ‑CSF、 CMV‑GFP、 4xmiRT124和ICP34.5两端序列， 以及质 粒pCMV‑GFP连接起来， 形成完整的供体质粒， 记为pUL34.5 ‑hGM‑CSF‑lox2272‑CMV‑eGFP‑ lox2272‑4xmiRT124； S3.设计针对ICP34.5区域的sgRNA， 并通过酶切连接的方式连接至Lenti ‑CRISPR‑V2载 体上， 记为 Lenti‑CRISPR‑ICP34.5； S4.将供体质粒pUL34.5 ‑hGM‑CSF‑lox2272 ‑CMV‑eGFP‑lox2272 ‑4xmiRT124和靶向 ICP34.5的Lenti ‑CRISPR‑ICP34.5质粒共同转染HEK293T细胞， 待细胞完全病变后， 收取培 养上清； 将上清加入至Ver o细胞中， 数小时后， 观 察荧光蚀斑， 并挑取荧光蚀斑； 获得插入了 hGMCSF、 CMV‑GFP、 4xmiRT124的HSV ‑1， 记为oHSV‑GFP； S5.以带有Cre片段的质粒为模板， 扩增Cre片段， 并通过酶切连接的方法连接至pCCL ‑ PGK‑eGFP载体上， 记为pC CL‑PGK‑eGFP； S6.将步骤S5制备的pCCL ‑PGK‑Cre质粒转染HEK293T细胞， 以MOI＝1.0的剂量加入步骤 S4制备的oHSV ‑GFP， 待细胞完全病 变后， 收取培养上清； 将上清加 入至Vero细胞中， 观察无 荧光蚀斑， 并挑取 无荧光蚀斑； 获得插 入了hGMCSF和4xmiRT124的HSV ‑1， 记为oHSV。 7.根据权利要求6所述 抗肿瘤药物组合物， 其特 征在于， 步骤S4包括如下步骤： 将供体质粒pUL34.5 ‑hGM‑CSF‑lox2272‑CMV‑eGFP‑lox2272‑4xmiRT124和靶向ICP34.5 的Lenti‑CRISPR‑ICP34.5质粒共同转染HEK293T细胞， 24小时后， 以MOI＝1.0的剂量加入 HSV‑1， 待细胞完全病变后， 收取培养上清； 以10倍比稀释的方法， 将上清加入至Vero细胞 中， 48小时后， 观察荧光蚀斑， 并挑取荧光蚀斑； 经过多轮纯化， 获得插入了hGMCSF、 CMV ‑权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114010666 A 2GFP、 4xmiRT124的HSV ‑1， 记为oHSV‑GFP。 步骤S6包括如步骤： 将步骤S5制备的pCCL ‑PGK‑Cre质粒转染HEK293T细胞， 24小时后， 以MOI＝1.0的剂量加 入步骤S4制备的oHSV ‑GFP， 待细胞完全病变后， 收取培养上清； 10倍倍比稀释的方法， 将上 清加入至Vero细胞中， 48小 时后， 观察无荧光蚀斑， 并挑取无荧光蚀斑； 以上述方法经过多 轮纯化， 获得插 入了hGMCSF和4xmiRT124的HSV ‑1， 记为oHSV。 8.一种抗肿瘤用药系统， 其特征在于： 所述系统包括权利要求1 ‑7中任一项所述的抗肿 瘤药物组合物。 9.一种如权利要求1 ‑8中任一项所述的抗肿瘤药物组合物在制备抗肿瘤药物或制 剂中 的应用。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特征在于： 所述的肿瘤为肝癌、 结直肠癌、 膀胱癌、 乳 腺癌、 宫颈癌、 前列腺癌、 胶质瘤、 黑色素瘤、 胰腺癌、 鼻咽癌、 肺癌或胃癌。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114010666 A 3