(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111247637.7 (22)申请日 2021.10.26 (71)申请人 江苏大学 地址 212013 江苏省镇江市京口区学府路 301号 (72)发明人 屠志刚　周天楚　卢子文　刘晗青　 (51)Int.Cl. C12N 15/113(2010.01) C12N 15/867(2006.01) A61K 31/713(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 特异性抑制KSR 1基因表达的shRNA及其应用 (57)摘要 本发明提供了一种特异性抑制KSR1基因表 达的shRNA及应用， 属于结肠癌基因沉默治疗技 术领域； 本发明基于KSR1基因的mRNA序列， 设计 筛选出2条shRNA并基于shRNA构建慢病毒载体 pLKO.1‑TRC‑shKSR1(简称为shKSR1)， 通过实验 发现shRNA可以显著降低KSR1基因在结肠癌 细胞 中的表达； 所述shRNA在未来结肠癌的靶向基因 药物研发中具有巨大的潜在价 值。 权利要求书1页 说明书5页 序列表8页 附图1页 CN 114107293 A 2022.03.01 CN 114107293 A 1. 一种特异性抑制KSR1基因表达的shRNA序列， 其特征在于， 所述shRNA为shKSR1 ‑1  或shKSR1‑2； 其中， shKSR 1‑1 的序列为： F:CCGACTTCGAGAAGTTCTTTCTCGAGCTCGAGA AAGAACTTCTCGAAGTCAAAAA(SEQ.ID.NO.1)； R:CAAAAACTGAAGCTCTTCAAGAAAGAGCTCGAGCTCTTTCTTGAAGAGCTTCAGCCGG (SEQ.ID.NO.2)； 所述shKSR 1‑2序列为： F:CCGGGGCATCGTACACAAAGATCTCCTCGAGGAGATCTTTGTGTACGATGCCTTTTTG (SEQ.ID.NO.3)； R:GGCCGACTTCGAGAAGTTCTTTCTCGAGCTCGAGA AAGAACTTCTCGAAGTCAAAAA(SEQ.ID.NO.4)。 2.一种shRNA慢病毒表达载体Plko.1 ‑TRC‑shRNA‑KSR1， 其特征在于， 所述shRNA慢病毒 表达载体Pl ko.1‑TRC‑shRNA‑KSR1包含上述shRNA序列。 3.根据权利要求2所示的shRNA慢病毒表达载体Plko.1 ‑TRC‑shRNA‑KSR1， 其特征在于， 所述Plko.1‑TRC‑shRNA‑KSR1为pLKO.1 ‑TRC‑shKSR1‑1和pLKO.1 ‑TRC‑shKSR1‑2。 4.根据权利要求3所示的shRNA慢病毒表达载体Plko.1 ‑TRC‑shRNA‑KSR1， 其特征在于， 所述pLKO.1 ‑TRC‑shKSR1‑1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示， 所述pLKO.1 ‑TRC‑shKSR1‑2 的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。 5.一种含有权利要求2 ‑4中任一项所述慢病毒表达载体的转基因细胞或工程菌 。 6.权利要求1所述shRNA序列或权利要求2所述表达载体Plko.1 ‑TRC‑shRNA‑KSR1或权 利要求5所述的转基因细胞或工程菌在非治疗与诊断目的的特异 性抑制结肠癌细胞中KSR1 基因表达中的应用。 7.根据权利要求6所述的应用， 其特 征在于， 所述应用为抑制结肠癌细胞的增殖能力。 8.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于， 所述应用为获取抑制结肠癌细胞增殖的信 息。 9.权利要求1所述shRNA序列或权利要求2所述表达载体Plko.1 ‑TRC‑shRNA‑KSR1或权 利要求5所述的转基因细胞或工程菌在制备抑制结肠癌细胞增殖的药物中的应用。 10.一种抑制结肠癌细胞增殖的药物， 其特征在于， 所述药物包含权利要求1所述shRNA 序列或权利要求2所述表达载体Plko.1 ‑TRC‑shRNA‑KSR1或权利要求5所述的转基因细胞或 工程菌。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114107293 A 2特异性抑制KSR1基因表达的s hRNA及其应用 技术领域 [0001]本发明属于结肠癌基因沉默治疗技术领域， 具体涉及一种特异性抑制KSR1基因表 达的shRNA及其应用。 背景技术 [0002]RNA干扰技术(RNAinterference,  RNAi)是物种在进化上的一种高度保守的基因 防御机制， 即一种依赖于双链RNA特异 性短序列实现转录后的基因沉默的技术。 目前实验室 常用的RNAi技术主要有siRNA寡核苷酸载体与 shRNA慢病毒质粒表达载体。 siRNA是短的双 链RNA， 大小在19 ‑29 nt左右， 3 ´端有两个游离的碱基， 可激活RNA的干扰， 通过与目标mRNA 互补序列结合， 特异性地实现mRNA降解。 但是siRNA在细胞中的表达是瞬时的， 发挥作用的 时间比较短。 相对于siRNA， 短发夹核糖核 酸(Short  Hairpin RNA, shRNA)可以通过病毒介 导的转染保持稳定， 能够减少脱靶效应。 shRNA包括两个短的反向重复序列， 中间由茎环结 构进行分割， 组成一个类似发夹的结构 。 shRNA首先被插入到慢病毒 载体上形成重组慢病毒 质粒， 慢病毒质粒与其他辅助质粒借助于293FT细胞形成慢病毒， 最 终用慢病毒转 染细胞发 挥shRNA的沉默作用。 [0003]KSR1又称Ras  分子支架激酶抑制剂。 在Raf ‑MEK‑ERK激酶级联反应中， 起到分子支 架作用， 促进Raf家族成员的磷酸化和下游MAP激酶的激活； 同时参与调节多种细胞机制以 促进细胞增殖和存活， 包括 参与代谢调节、 DNA损伤后细胞周期的重新启动。 [0004]结直肠癌早期症状不明显， 其发病率和死亡率在消化系统恶性肿瘤中仅次于胃 癌、 食管癌和原发性肝癌。 虽然中 国属于低发地区， 但其 发生率在不少地区处于呈现上升趋 势。 全球统计显示， 结直肠癌患者分布广泛， 经济发达地区尤其严重。 由于经济文明的发展 导致饮食， 水质等 一系列变化可能是 结肠癌发病率逐年 提升的关键 。 [0005]目前医学上， 一般早期结肠癌推荐外科手术治疗， 辅以放化疗。 而对于中晚期， 特 别是发展严重转移后， 一般利用靶向药物进行治疗。 自从靶向药物获批以用于结直肠癌治 疗以后， 晚期的结直肠癌患者生存期具有显著提升。 但目前没有针对于结肠癌最重要的两 个突变— —RAS和W NT信号通路的靶向药物。 发明内容 [0006]针对现有技术中存在不足， 本发明提供了一种特异性抑制KSR1基因表达的shRNA 及应用。 本发明基于KSR1基因的mRNA序列， 设计筛选出2条shRNA并基于shRNA构建慢病毒 载 体pLKO.1 ‑TRC‑shKSR1(简称为shKSR1)， 通过 实验发现shRNA可以显著降低KSR1基因在结肠 癌细胞中的表达； 所述shRNA在未来结肠癌的靶向基因药物研发中具有巨大的潜在价 值。 [0007]本发明中首先提供了特异性抑制KSR1基因表达的shRNA序列， 所述shRNA为 shKSR1‑1 或shKSR1‑2； 其中， shKSR 1‑1 的序列为： F:CCGACTTCGAGAAGTTCTTTCTCGAGCTCGAGAAAGAACTTCTCGAAGTCAAAAA说　明　书 1/5 页 3 CN 114107293 A 3