(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111262776.7 (22)申请日 2021.10.28 (71)申请人 钟莉娉 地址 530025 广西壮 族自治区南宁市青秀 区民族大道19 9号尚城街区 (72)发明人 赵永祥　钟莉娉　 (74)专利代理 机构 上海德禾翰通 律师事务所 31319 代理人 夏思秋 (51)Int.Cl. C12N 7/01(2006.01) C12N 15/86(2006.01) C12N 15/13(2006.01) C12N 15/54(2006.01) A61K 35/768(2015.01)A61K 39/17(2006.01) A61K 39/12(2006.01) A61K 9/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 35/04(2006.01) A61P 31/14(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 生物制导溶瘤病毒制剂及应用 (57)摘要 本发明公开了一种生物制导溶瘤病毒制剂 及应用， 所述病毒为包含重组NDV ‑EPGPF质粒的 重组新城疫溶瘤病毒， 所述重组新城疫溶瘤病毒 由重组NDV ‑EPGPF质粒与辅助质粒共转染BSR细 胞拯救获得。 所述重组NDV ‑EPGPF质粒是包含重 组α1,3 GT、 CD105  scFv、 PD‑1scFv、 PD ‑L1 scFv 和FAP scFv基因的NDV质粒； 所述CD105  scFv基 因的序列如SEQ  ID NO:1所示； 所述PD ‑1scFv基 因的序列如SEQ  ID NO:2所示； 所述α ‑1,3 GT基 因的序列如SEQ  ID NO:3所示； 所述PD ‑L1 scFv 基因的序列如SEQ  ID NO:4所示； 所述FAP  scFv 基因的序列如SEQ  ID NO:5所示。 本发明还公开 了一种上述重组新城疫溶瘤病毒的制备方法及 重组新城疫溶瘤病毒在静脉注 射抗肿瘤、 摧毁肿 瘤骨架结构， 激活T细胞功能中的应用。 权利要求书2页 说明书12页 序列表3页 附图2页 CN 114058597 A 2022.02.18 CN 114058597 A 1.一种包含重组NDV ‑EPGPF质粒的重组新城疫溶瘤病毒， 其特征在于， 所述重组新城疫 溶瘤病毒由重组新城疫病毒NDV ‑EPGPF质粒与辅助质粒共转染BSR细胞拯救获得。 2.如权利要求1所述的重组新城疫溶瘤病毒， 其特 征在于， 所述辅助质粒包括 N、 P、 L。 3.如权利要求1所述的重组新城疫溶瘤病毒， 其特征在于， 所述重组新城疫病毒NDV ‑ EPGPF质粒是在NDV上重组包含CD105  scFv、 PD‑1scFv、 α 1,3GT、 PD ‑L1 scFv和FAP scFv基因 的重组新城疫病 毒NDV‑EPGPF质粒； 所述CD 105 scFv基因 的序列如SEQ  ID NO:1所示； 所述 PD‑1scFv基因 的序列如SEQ  ID NO:2所示； 所述α 1,3GT基因 的序列如SEQ  ID NO:3所示； 所 述PD‑L1 scFv基因的序列如SEQ  ID NO:4所示； 所述FAP  scFv基因的序列如SEQ  ID NO:5所 示。 4.重组新城疫病毒NDV ‑EPGPF质粒， 其特征在于， 其为在NDV上重组包含CD105  scFv、 PD‑1scFv、 α 1,3GT、 P D‑L1 scFv和FAP  scFv基因的重组新城疫病毒NDV ‑EPGPF质粒。 5.如权利要求4所述的重组新城疫病毒NDV ‑EPGPF质粒， 其特征在于， 所述CD105  scFv 基因的序列如SEQ  ID NO:1所示； 所述PD ‑1scFv基因的序列如SEQ  ID NO:2所示； 所述α 1, 3GT基因的序列如SEQ  ID NO:3所示； 所述PD ‑L1 scFv基因的序列如SEQ  ID NO:4所示； 所述 FAP scFv基因的序列如SEQ  ID NO:5所示。 6.如权利要求 4或5所述的重组NDV ‑EPGPF质粒在构建重组新城疫溶瘤病毒中的应用。 7.一种制备如权利要求1 ‑3之任一项所述的重组新城疫溶瘤病毒的制备方法， 其特征 在于， 所述方法包括如下步骤： 步骤一、 构建所述的重组新城疫病毒NDV ‑EPGPF质粒； 步骤二、 提取包含测序正确的重组α1,3GT、 CD105  scFv、 PD‑1scFv、 PD ‑L1 scFv和FAP   scFv基因的重组新城疫病毒NDV ‑EPGPF质粒； 步骤三、 BSR细胞复苏、 换 液、 传代和铺板； 步骤四、 利用痘苗病毒感染BSR细胞， 然后用所述步骤二中提取的重组新城疫病毒NDV ‑ EPGPF质粒对BSR细胞进行转染； 步骤五、 取 所述步骤四转染后的细胞 上清接种到鸡胚中， 拯救病毒； 步骤六、 从所述步骤五中的鸡胚中收毒， 检测血凝效价， 确认获得重组新城疫溶瘤病 毒。 8.如权利 要求6所述的方法， 其特征在于， 步骤一中， 所述的新城疫病毒NDV ‑EPGPF重组 质粒的构建方法包括以下步骤： (1)线性化超敏NDV载体： 用Age  I和SanD I双酶切超敏NDV骨架载体TVT/071204， 回收 载体大片段； (2)扩增目的基因片段； (3)将所述步骤(1)回收的载体片段与所述步骤(2)的目的基因片段进行连接， 连接产 物转化至TransStbl3感受态细胞， 抽提质粒， 通过PCR和Age  I、 SanD I双酶切鉴定获得阳性 重组NDV质粒， 命名为重组新城疫病毒NDV ‑EPGPF质粒。 9.如权利要求8所述的方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 所述扩增中引物的序列如下所 示： PF： CCCAAGGTCCAACTCTGTTTAAACTTAGAAAAAATACGGGTAGAAGTGCCACCGACCCCCGGGTCCGCCCG权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114058597 A 2PR： AGGATTGCCGCTTGGGTTTAAACTCATTTGATTTCCACTTTGGTCC； 所述扩增目的基因片段的PCR体系如表3所示； 所述扩增的条件如表4所示。 10.一种静脉注射制剂， 其特征在于， 所述静脉注射制剂包括如权利要求1 ‑3之任一项 所述的重组新城疫溶瘤病毒。 11.如权利要求1 ‑3之任一项所述的重组新城疫溶瘤病 毒、 或如权利要求10所述的静脉 注射制剂在制备 预防和/或治疗新城疫病毒中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114058597 A 3