(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111118515.8 (22)申请日 2021.09.24 (71)申请人 上海蔚之星生物科技有限公司 地址 200241 上海市闵行区园美路58号2幢 208室 (72)发明人 邱蔚然　邱志云　周洁　陈修足　 王军　欧伶　 (74)专利代理 机构 上海集信知识产权代理有限 公司 31254 专利代理师 洪玲 (51)Int.Cl. C07H 19/20(2006.01) C07H 19/10(2006.01) C07H 1/06(2006.01) A61K 31/708(2006.01)A61K 31/7076(2006.01) A61K 31/7072(2006.01) A61K 31/7068(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 7/00(2006.01) (54)发明名称 脱氧核苷酸层析分离方法及脱氧核苷酸钠 原料药的制备 (57)摘要 本发明公开了一种脱氧核苷酸层析分离方 法及脱氧核苷 酸钠原料药的制备， 采用实时在线 检测和智能化控制对DNA酶解液进行层析分离， 通过核酸蛋白检测仪的实时在线检测， 监控上 样、 水洗过程中是否有脱氧核苷酸流出， 从而了 解这一过程是否正常运转； 通过定时在线取样和 HPLC检测器分析， 控制 分段洗脱过程和收集5 ’ ‑ dCMP、 5’ ‑dAMP、 5’ ‑dTMP和5’ ‑dGMP四种脱氧核苷 酸溶液； 本发 明不仅实现了整个层析分离全流程 无人化操作， 过程控制更加精密便捷， 省时省力， 减少人为误差， 避免生产受到损失， 而且能得到 纯度≥99％的单一组分的脱氧核苷酸， 并将单一 组分的脱氧核苷酸按一定比例 复配成脱氧核苷 酸钠原料 药。 权利要求书2页 说明书10页 附图3页 CN 114874275 A 2022.08.09 CN 114874275 A 1.一种脱氧核苷酸层析分离方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)上样， 将过滤后的DNA酶解液依次通过由1根阳离子交换树脂柱和多根阴离子交换 树脂柱串联的柱层析系统， 并采用核酸蛋白检测仪对最后一根阴离子交换树脂柱的流出液 进行实时在线检测； (2)水洗， 上样结束后， 采用去离子水或纯化水对所述柱层析系 统进行水洗， 去除所述 柱层析系统中的残留杂质； (3)分段洗脱， 断开所述阳离子交换树脂柱， 对串联的多根阴离子交换树脂柱进行洗 脱， 同时采用HPLC检测 器对最后一根阴离子交换树脂柱的流出液进行定时检测， 并分别收 集5’ ‑dCMP、 5’ ‑dAMP、 5’ ‑dTMP和5’ ‑dGMP四种脱氧核苷酸； (4)浓缩， 将收集的5 ’ ‑dCMP、 5’ ‑dAMP、 5’ ‑dTMP分别通入对应的炭柱中， 然后分别对每 根炭柱洗脱， 再分别收集5 ’ ‑dCMP、 5’ ‑dAMP、 5’ ‑dTMP溶液， 并分别将四种脱氧核苷酸进行结 晶、 过滤、 干燥。 2.根据权利要求1所述的脱氧核苷酸层析分离方法， 其特 征在于， 所述 步骤(1)中： 所述柱层析系统中， 所述阴离 子交换树脂柱至少采用2根； 和/或 所述阳离子交换树脂柱和阴离子交换树脂柱均采用盐酸或NaOH进行再生处理， 所述阳 离子交换树脂柱为Na型阳离子交换树脂柱， 所述阴离子交换树脂柱 为Cl型阴离子交换树脂 柱； 和/或 所述上样过程中， 所述DNA酶解液的流速为120～180L/ h； 和/或 所述上样过程中， 当所述核酸蛋白检测仪检测到最后 一根阴离子交换树脂柱流出液中 A260＜1时排废， 反 之则上样结束。 3.根据权利要求1所述的脱氧核苷酸层析分离方法， 其特 征在于， 所述 步骤(2)中： 所述水洗过程中， 所述去离子水或纯化水的体积为所述阴离子交换树脂柱的柱体积的 5～10倍； 和/或 所述水洗过程中， 采用核酸蛋白检测仪对所述柱层析系统的流出液进行检测， 当柱层 析系统流出 液中A260＜1时， 排废； 反 之则收集 流出液。 4.根据权利要求1所述的脱氧核苷酸层析分离方法， 其特 征在于， 所述 步骤(3)中： 所述分段洗脱过程中， 采用0.01mol/L甲酸洗脱5 ’ ‑dCMP， 当所述HPLC检测器检测出5 ’ ‑ dCMP且浓度≥0.5g/L时， 收集5 ’ ‑dCMP溶液； 采用0.1mol/L甲酸洗脱5 ’ ‑dAMP， 当所述HPLC检 测器检测出5 ’ ‑dAMP且浓度≥0.5g/L时， 收集5 ’ ‑dAMP溶液； 采用0.1mol/L甲酸 ‑0.1mol/L甲 酸钠洗脱5 ’ ‑dTMP， 当所述HPLC检测器检测出5 ’ ‑dTMP且浓度≥0.5g/L时， 收集5 ’ ‑dTMP溶 液； 采用质量百分浓度为3％的NaCl洗脱5 ’ ‑dGMP， 当所述HPLC检测器检测出5 ’ ‑dGMP且浓度 ≥0.5g/L时， 收集5 ’ ‑dGMP溶液。 5.根据权利要求1所述的脱氧核苷酸层析分离方法， 其特 征在于， 所述 步骤(4)中： 所述炭柱洗脱过程中， 采用氨乙醇溶 液或NaOH ‑乙醇溶液作为洗脱液进行洗脱； 和/或 所述炭柱洗脱过程中， 采用HPLC检测器对炭柱流出液进行定时检测， 当炭柱流出液检 测出5’ ‑dCMP且浓度≥0.5g/L时， 收集5 ’ ‑dCMP溶液； 当炭柱流出液检测出5 ’ ‑dAMP且浓度≥ 0.5g/L时， 收集5 ’ ‑dAMP溶液； 当炭柱流出液检测出5 ’ ‑dTMP且浓度≥0.5g/L时， 收集5 ’ ‑ dTMP溶液。 6.根据权利要求5所述的脱氧核苷酸层析分离方法， 其特征在于， 所述炭柱洗脱过程权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114874275 A 2中， 所述氨乙醇溶液采用氨水、 95％乙醇和水配比而成， 所述氨水、 95％乙醇和水的体积比 为5： 50:45。 7.一种脱氧核苷酸钠原料药的制备， 其特征在于， 原料包括如权利要求1 ‑6任一项所述 的脱氧核苷酸层析分离方法制备的5 ’ ‑dCMP、 5’ ‑dAMP、 5’ ‑dTMP和5’ ‑dGM； 所述5’ ‑dCMP、 5’ ‑dAMP、 5’ ‑dTMP和5’ ‑dGM的含量均≥98％。 8.根据权利要求7所述的脱氧核苷酸钠原料药的制备， 其特征在于， 所述原料包括按重 量百分比计的如下组分： 权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114874275 A 3