(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202111106613.X (22)申请日 2021.09.2 2 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 113786416 A (43)申请公布日 2021.12.14 (73)专利权人 北京赛尔再生医学生物科技有限 公司 地址 102600 北京市大兴区北京经济技 术 开发区永昌北路3号3幢1层8108 （北京 自贸试验区高端产业片区亦庄组团） (72)发明人 张克礼　顾超　 (74)专利代理 机构 江苏长德知识产权代理有限 公司 32478 专利代理师 刘传玉 (51)Int.Cl. C12N 5/10(2006.01) C12N 15/62(2006.01) A61K 35/17(2015.01)A61K 38/20(2006.01) A61K 38/19(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61K 9/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (56)对比文件 WO 2010071836 A1,2010.0 6.24 CN 111918661 A,2020.1 1.10 WO 20210 54789 A1,2021.0 3.25 董茜 等人.I Ｌ-15对人外周血ＮＫ细胞内 ＴＮＦ-α表达的促进作用. 《细胞与分子免疫学 杂志》 .20 06, Jiwon Lee等人.Tumor necrosis factor-a enhances I L-15-induced natural k iller cell differentiati on. 《Biochemical and Biophysical Researc h Communications》 .2009, 审查员 王帆 (54)发明名称 转基因的NK细胞在治 疗癌症中的用途 (57)摘要 本发明涉及转基因的NK细胞在治疗癌症中 的用途。 本发明通过针对TNF ‑α筛选高活性突变 位获得了高活性的T NF‑α突变蛋白， 将所述T NF‑ α蛋白与IL ‑15一起共表达在NK细胞中能够显著 的促进NK细胞的增殖以及杀伤活性， 将其用于制 备药物组合物可以用于癌症的治疗， 具有极好的 应用前景。 权利要求书1页 说明书6页 序列表3页 附图3页 CN 113786416 B 2022.08.05 CN 113786416 B 1.一种转基因的NK细胞在制备用于癌症治疗的药物组合物中的用途； 其中， 所述NK细 胞含有的基因为序列如SEQ  ID NO： 5所示融合基因， 融合基因对应的氨基酸序列为将SEQ   ID NO： 3所示的IL ‑15采用T2A连接子与102L/R  突变的SEQ  ID NO： 2的TNF ‑α 氨基酸序列 连 接 。 2.如权利要求1所述的用途， 其特 征在于所述 NK细胞为 NK‑92细胞。 3.如权利要求2所述的用途， 其特 征在于所述癌症是乳腺癌。 4.如权利要求1所述的用途， 其特征在于药物组合物还包括通常用于制备药物组合物 的药学上可接受的载体、 赋 形剂或稀释剂。 5.如权利要求1所述的用途， 其特 征在于所述药物组合物为注射剂的形式。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 113786416 B 2转基因的NK细胞在治疗癌症中的用途 技术领域 [0001]本发明涉及生物领域， 更 具体涉及转基因的NK细胞在治疗癌症的中的用途。 背景技术 [0002]NK细胞是具有多种免疫学功能的淋巴样细胞。 人类NK细胞为CD56和CD16阳性 .CD3、 CIM和CD 19为阴性。 少部分NK细胞可以为CD8阳性。 小鼠NK细胞为NK1.1和 ASGM1阳性， CD3、 CIM和cr18为阴性NK细胞杀伤肿瘤细胞不受MHC限制， 也不需预先与抗原接触或显示任 何记忆反应。 NK细胞对肿瘤的杀伤优势表现为直接溶解和分泌细胞因子两个方面， 其杀伤 肿瘤既可通过穿孔素又可通过Fas配基。 NK细胞可以产生TNF ‑a、 IFN‑γ和IL‑1， 这些细胞因 子在NK细胞抗癌反应中有十分重要地位。 NK细胞具有对异体骨髓快速排异的能力， 但并不 介导实体组织的移植 排异。 [0003]NK细胞具有 杀伤细胞 活化受体(killeractivat oryrecept or， KAR)、 杀伤细胞抑制 受体(killerinhibitoryreceptor， KIR)、 杀伤细胞凝集素样受体(killerlectin ‑ likereceptors， KLR)和Fcγ受体(CD16)共4种受体， 前3种受体可抑制或激活NK细胞， 使之 识别自身组织细胞与体内异常组织细胞的能力， 第4种受体主要识别NK细胞表面的IgG1和 IgG3标志物， 介导NK细胞识别被抗体包被的靶细胞， 从而发挥抗体依赖性细胞介导的细胞 毒作用(antibodydependent cell‑mediatedcytotox icity， ADCC)， 进而杀伤与IgG抗体 特异 性结合的肿瘤。 NK细胞具有较广的抗瘤谱， 可杀伤同系、 同种或异种肿瘤细胞， 其杀伤靶细 胞的机制可能有: ①释放穿孔素和颗粒酶引起靶细胞坏死或凋亡。 ②通过死亡受体调节诱 导靶细胞凋亡。 ③分泌多种效应性细胞因子对抗 转移肿瘤。 ④激发继发肿瘤免疫效应。 [0004]NK细胞可以被IL ‑2、 IL‑12、 IL‑15等所活化.其中IL ‑15和Fh‑3配基在NK细胞分化 中尤为重要。 活化的NK细胞产生大量的细胞因子， 包括IL ‑1、 TNF‑a、 IFNG‑CSF和GM‑CSF。 这 些细胞因子极有可能参与造血 的正负调节。 当活化NK细胞转输体内， 小鼠同基因骨髓移植 的造血恢复过程明显加快， 尤其是 粒细胞和血小板的恢复加快， 显示出一定的应用前 景。 [0005]研究表明细胞因子基因修饰可增强NK细胞功能。 细胞因子IL ‑12可增强NK细胞的 增殖能力和效应功能Goding等利用小鼠IL ‑12基因来修饰依赖IL ‑2活化的鼠原代NK细胞， 从而减少对外源性IL ‑2的需求。 该研究利用一种腺病毒载体实现GFP/荧光素酶/β ‑gal和 mlL‑12基因的瞬时过表达， 可使得高达80％的细胞表达绿色荧光蛋白， 在转入48h后， 这些 细胞中IL ‑12的分泌量到达 峰值， 而紧接下来由于腺病毒载体表达的短暂性， 其水平下降。 这项研究同时表明， 在接受外源性IL ‑2注射的同时， 利用表达mlL ‑12的NK细胞治疗B16肺转 移瘤小鼠， 可显著 提高其生存期， 这与mlL ‑12‑NK细胞功能的增强以及在肿瘤组织的积累有 关。 另有研究表明， 过继转输 mlL‑12修饰的NK细胞能进一步增强未修饰NK细胞的功能， 说明 NK细胞分泌I L.12可以激活邻近的细胞， 导 致周围的免疫细胞活化， 从而提高免疫应答。 [0006]干细胞因子(SCF)联合IL ‑2、 IL‑15可以显著提高NK细胞的增殖能力并促进其进化 Zhang等采用脂质体将SCF载体转染入NK ‑92细胞， 在IL ‑2或IL‑l5存在条件下进行培养， 其 增殖能力显著增强； 在同样的培养条件 下， 与未修饰的对照组相比， SCF修饰的NK ‑92细胞对说　明　书 1/6 页 3 CN 113786416 B 3