(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202111171729.1 (22)申请日 2021.10.08 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 113896801 A (43)申请公布日 2022.01.07 (73)专利权人 南京凯地医疗技 术有限公司 地址 211500 江苏省南京市江北新区华康 路142号南京生物医药谷加速器三期 A02栋4楼 (72)发明人 代红久　徐慧　朱靓婧　 (74)专利代理 机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 专利代理师 唐循文 (51)Int.Cl. C07K 19/00(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 7/01(2006.01) C12N 15/867(2006.01) A61K 39/00(2006.01) A61P 31/04(2006.01) A61P 31/12(2006.01)A61P 35/00(2006.01) A61P 35/02(2006.01) A61P 37/02(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (56)对比文件 CN 112500497 A,2021.0 3.16 CN 10945 6942 A,2019.0 3.12 CN 113416260 A,2021.09.21 CN 111234033 A,2020.0 6.05 CN 112940124 A,2021.0 6.11 CN 113354739 A,2021.09.07 WO 20191 14751 A1,2019.0 6.20 Uri Greenbaum等.C himeric Antigen Receptor Therapy: Ho w Are We Drivi ng in Solid Tumors?. 《Bi ology of Bl ood and Marrow Transplantati on》 .ELSEVIER,2020,第 26卷(第10期), 张欢等.嵌合 抗原受体T细胞治 疗多发性骨 髓瘤的研究进 展. 《山东医药》 .万方,2020,第6 0 卷(第26期), 审查员 蒋超 (54)发明名称 靶向人Claudin18.2和NKG2DL的嵌合抗原受 体细胞及其制备方法和应用 (57)摘要 本发明属于嵌合抗原受体细胞领域， 一种靶 向人Claudin18.2和NKG2DL的嵌合抗原受体细胞 及其制备方法和应用,该嵌合抗原受体细胞含有 靶向结合人Claudin18.2和靶向结合人NKG2DL的 氨基酸序列。 本发明的靶向Claudin18.2和 NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体修饰的免疫应 答细胞能增强与肿瘤细胞的结合， 明显提高抗肿 瘤活性。 权利要求书1页 说明书15页 序列表14页 附图8页 CN 113896801 B 2022.05.17 CN 113896801 B 1.一种靶向人Claudin18.2和NKG2DL的嵌合抗原受体， 其特征在于所述的嵌合抗原受 体的氨基酸序列为： 由如SEQ ID No.1所示引导肽氨基酸序列、 如SEQ  ID No.2或SEQ  ID No.3所示 Claudin18.2的抗体scFv氨基酸序列、 如SEQ  ID No.5所示人NKG2D氨基酸序列、 如SEQ  ID  No.10所示人CD8铰链区的氨基酸序列、 如SEQ  ID No.11所示人CD8跨膜区的氨基酸序列、 如 SEQ ID No.13所示人4 ‑1BB胞内结构域的氨基酸序列、 如SEQ  ID No.16所示人CD3ζ结构域 的氨基酸序列依次串联而成。 2.编码权利要求1所述的嵌合 抗原受体的核酸分子， 其特 征在于： 包括从5 ’到3’依次串联连接的编码所述引导肽序列的核苷酸序列、 编码靶向 Claudin18.2的抗体scFv的核苷酸序列、 编码人NKG2D的核苷酸序列、 编码铰链区的核苷酸 序列， 编码跨膜结构域的核苷酸序列、 编码胞内信号结构域的核苷酸序列。 3.一种重组载体， 其特 征在于包 含权利要求2中所述的核酸分子 。 4.一种重组病 毒， 其特征在于包括权利要求3所述的重组载体和病 毒颗粒； 所述病 毒包 括慢病毒、 腺病毒、 腺联病毒或逆转录病毒。 5.一种功能化免疫应答细胞， 其特征在于其是通过采用如权利要求4所述的重组病毒 感染免疫效应细胞获得； 所述免疫效应细胞包括细胞毒性T淋巴细胞、 NK细胞、 NKT细胞、 辅 助性T细胞或巨噬细胞。 6.一种生物制品， 其特征含有权利要求1所述的嵌合抗原受体； 或含有权利要求2所述 的核酸分子； 或含有权利要求3所述的重组载体； 或含有权利要求4所述的重组病毒； 或含有 权利要求5所述的功能化免疫应答细胞。 7.根据权利要求6所述的生物制品在制备治疗癌症药物中的应用； 所述的癌症为 NKG2DL阳性和/或Claudin18.2阳性的肿瘤， 其为胃癌、 胰腺癌、 肝癌、 脑癌、 前列 腺癌、 淋巴 癌、 白血病 、 肠癌、 肺癌或乳腺癌。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 113896801 B 2靶向人Cla udin18.2和NKG2D L的嵌合抗原受体细胞及其制备 方法和应用 技术领域 [0001]本发明属于嵌合抗原受体细胞领域， 涉及一种双特异性靶向人Claudin18.2 (CLDN18.2)和NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体的氨基酸编码序列、 及其修饰的免疫应答细 胞， 以及它 们的制备 方法和在药物制备中的应用。 背景技术 [0002]随着生物技 术的飞速发展， 免疫细胞治疗已成为癌症治疗领域的第四大疗法。 [0003]癌症免疫疗法主要包括过继性细胞治疗、 免疫调节剂、 肿瘤疫苗以及免疫结合点 阻断治疗等。 其中， 在细胞治疗领域， CAR ‑T疗法无疑已成为研究机构和制药公司争相 “追 捧”的明星。 [0004]CAR‑T(Chimer ic Antigen Receptor  T‑Cell， 嵌合抗原受体修饰的T细胞)为代表 的免疫疗法， 其原理主要是通过基因工程手段对病 人自身提取 的T细胞进行嵌合抗原受体 的修饰形成CAR ‑T细胞， 该T细胞能特异性地识别肿 瘤表面相关抗原(肿瘤细胞标志物)， 从 而靶向杀伤肿瘤。 [0005]近年研究表明， NKG2DL蛋白的表达是细胞处于 “应激状态 ”的一个指标， 其在健康 组织中很少有表达或仅短暂地表达， 而通常在不同来源的各种肿瘤细胞表面有较高水平的 表达。 NKG2DL蛋白的受体为NKG2D， 研究显示， NKG2D ‑NKG2DL系统在机体的抗肿瘤免疫中发 挥着重要作用， NKG2D通过识别肿 瘤细胞表面产生的NKG2DL来传递活化信号并激活免疫系 统， 从而对肿瘤细胞发挥杀伤作用。 除此之外， 研究发现自身免疫性疾病患者的血清中含有 可溶性NKG2DL， NKG2D ‑NKG2DL系统在治疗自身免疫性疾病、 抗炎、 抗衰老等方面起到一定作 用(参见Legroux  L等人， Frontiers  in Immunolo gy， (2019))。 因此， NKG2DL的表达作 为机 体发生肿瘤时肿瘤细胞上的一个特异性的改变， 为肿瘤的免疫治疗提供了一个更为精确的 靶点， 为相关新疗法和药物的开发提供了启示。 [0006]此外， 有研究表明， 紧密连接蛋白Claudin是一种四次跨膜蛋白， NH2端和COOH端位 于胞内， 具有两个胞外环， 迄今为止一共发现了27个家族成员。 Claudin18.2是Claudin家族 中在上皮紧密连接处表达的四次跨膜蛋白， 是细胞紧密连接的重要分子， 其构成了细胞旁 屏障， 控制细胞间分子流动。 Claudin18.2是一个高度特异性的细胞表面分子， 在正常的组 织中仅表达在分化的胃粘膜上皮细胞上， 使得开发针对Claudin18.2的治疗性抗体具有更 大的抗癌潜力、 更低的毒性， 有更大的最佳用药剂量空间。 Claudin18.2蛋白在胃癌、 胰腺 癌、 卵巢癌、 胆管癌和肺腺癌等实体瘤中高表达(参见Sahin等人， Clinical  Cancer  Research(2 008))。 另外据专家披露， Claudin18.2高表达的肿瘤往往不表达PD ‑L1， 对PD‑L1 靶向的免疫抑制药物 不敏感， 因此是一个临床需求高度未被满足的领域。 Claudin18.2在正 常组织中的独特表达谱， 以及在多种肿瘤中的异常表达情况使其成为了非常有吸引力的抗 癌治疗靶标。 同时Claudin18.2作为细胞膜表面蛋白， 暴露的胞外结构允许抗体的结合， 这 些特点表明Claudi n18.2是一个理想的治疗性靶点。说　明　书 1/15 页 3 CN 113896801 B 3