(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111163687.7 (22)申请日 2021.09.3 0 (71)申请人 中国人民解 放军陆军 军医大学 地址 400038 重庆市沙坪坝区高滩岩正 街 30号 (72)发明人 敖罗权　徐祥　敖翔　 (74)专利代理 机构 重庆市前沿专利事务所(普 通合伙) 50211 代理人 肖秉城　郭云 (51)Int.Cl. C07K 19/00(2006.01) C12N 15/62(2006.01) A61K 39/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 靶向叶酸受体α嵌合抗原受体、 其制备方法 及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种靶向叶酸受体α嵌合抗 原受体， 属于生物技术领域， 包括人CD8α信号 肽、 结合叶酸受体α的多肽、 人免疫球蛋白G1  Fc 段、 人CD8α铰链区、 人NKG2D跨膜段、 人2B4胞内 段、 人CD3ζ胞内段。 同时提供了 该嵌合抗原受体 的编码核苷酸分子、 表达载体、 宿主细胞以及该 嵌合抗原受体的制备方法。 本发 明还涉及包括该 嵌合抗原受体的药物及其在制备抗肿瘤药物中 的应用。 本发 明中的靶向叶酸受体α嵌合抗原受 体可增强NK细胞的特异性识别能力， 并增强其对 叶酸受体α阳性的结直肠癌细胞系的杀伤能力。 权利要求书1页 说明书10页 序列表3页 附图2页 CN 113896800 A 2022.01.07 CN 113896800 A 1.一种靶向叶酸受体α嵌合抗原受体， 其特征在于： 依次通过肽键连接有人CD8α信号 肽、 结合叶酸受体α 的多肽、 人免疫球蛋白G1  Fc段、 人CD8α 铰链区、 人NKG2D跨膜段、 人2B4胞 内段、 人CD3ζ 胞内段。 2.根据权利要求1所述靶向叶酸受体α 嵌合抗原 受体， 其特征在于： 所述靶向叶酸受体α 的嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ  ID NO.11所示。 3.根据权利要求1或2任意一项所述靶向叶酸受体α 嵌合抗原受体， 其特征在于： 所述结 合叶酸受体α 的多肽为抗叶酸受体α 抗体的单链可变区， 所述抗叶酸受体α 抗体的单链可变 区的C末端与人免疫球蛋白G1  Fc段的N末端 连接； 所述抗叶酸受体α 抗体的单链可变区包含 重链可变区和轻链可变区。 4.根据权利要求3所述靶向叶酸受体α嵌合抗原受体， 其特征在于： 所述轻链可变区的 氨基酸序列如SEQ  ID NO.14所示； 所述重链可变区序列如SEQ  ID NO.15所示。 5.一种核苷酸分子， 其特征在于： 所述核苷酸分子编码所述靶向叶酸受体α 嵌合抗原 受 体。 6.根据权利 要求5所述核苷酸分子， 其特征在于： 所述核苷酸分子序列如SEQ  ID NO.10 所示。 7.一种表达载体， 其特 征在于： 含有所述核苷酸分子 。 8.一种宿主细胞， 其特 征在于： 含有所述的表达载体。 9.一种靶向叶酸受体α 嵌合 抗原受体的制备 方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 构建含有权利要求1所述的靶向叶酸受体α嵌合抗原受体编码多聚核苷酸序列的表达 载体； 将所述表达载体转 化至宿主细胞中诱 导表达； 从表达产物中分离获得 所述靶向叶酸受体α 嵌合 抗原受体。 10.包括权利要求1所述的靶向叶酸受体α 嵌合 抗原受体的药物。 11.权利要求1所述的靶向叶酸受体α 嵌合 抗原受体在制备抗肿瘤药物中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 113896800 A 2靶向叶酸受体 α嵌合抗原受体、 其制备方 法及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及一种靶向叶酸受体α 嵌合抗原受体、 其制备方法及其应用， 属于生物技 术领域。 背景技术 [0002]随着社会发展， 环境污染日益严重， 人们的生活方式和饮食习惯发生改变， 癌症也 日益高发。 其中结直肠癌(colorectal  cancer， CRC)是消化系统中最常见的恶性肿瘤之一， 其发病率居于第三位， 病死率居于第二位。 CRC的治疗包括手术切除、 放疗和化疗等， 但 这些 治疗方法不但会引起不良反应而且在一定程度上治疗效果不佳。 然而随着免疫治疗在多种 肿瘤的综合治疗中取得了良好的疗效， 尤其是近年来兴起的嵌合抗原受体(chimeric   antigen receptor， CAR)技术在血液病肿瘤中取得良好的疗效， 为CRC治疗提供了新的思 路。 [0003]CAR通常包含两个主要的结构域： 靶向识别肿瘤抗原的单链可变区(single ‑chain  variable fragment， scFv)位于胞外和不同的胞内信号结构域位于胞内。 这种特殊的结构， 能使表达CAR的免疫效应细胞特异性杀伤表达特异性肿瘤抗原的肿瘤细胞。 目前多项临床 试验表明， CAR修饰的T细胞(即CAT ‑T)对白血病、 淋巴瘤等多种血液病恶性肿瘤 有极佳的疗 效。 目前已发展出三代CAR结构。 第一代CAR为胞内结构只含CD3ζ或FcεRIγ信号域， 改造后 的CAR‑T细胞增殖减少最终导致T细胞凋亡。 为了解决这个问题， 第二代、 第三代CAR则是在 第一代CAR结构的基础上将如CD28、 CD134和CD137等共刺激分子结构域整合入CAR中刺激T 细胞增殖与存活。 其中， CAR结构中包含一个共刺激分子结构域为第二代CAR， CAR结构中包 含两个共刺激分子结构域 为第三代CAR。 [0004]CAR‑T在使用过程中取得了很大成功， 展现出很好的治疗效果。 但也存在一定弊 端， CAR‑T只能使用取于自体的T细胞制备， 制备过程需要花费很长时间， 从而 可能会耽误宝 贵的治疗时间。 此外， 有些病人由于自身原因不适合取自身T细胞用于制备CAR ‑T， 这又进一 步限制了 CAR‑T的使用。 [0005]基于此， 就有学者提出采用嵌合抗原受体自然杀伤细胞(chimeric  antigen  receptor  natural killer cell， CAR ‑NK)治疗肿瘤。 相比于T细胞， 或许NK细胞是更好的 CAR的细胞载体： NK细胞可用于异体， 使其可以提前制备保存， 批量生产， 批量应用， 即需即 用。 但目前制备的CAR ‑NK主要是借鉴和 采用CAR‑T的CAR结构直接移植到NK细胞中， 这个方 法存在的最主要的问题是： 由于针对T细胞设计的CAR结构不适用于NK细胞， 所以对NK细胞 的激活作用很弱。 发明内容 [0006]本发明是提供一种靶向叶酸受体α 嵌合抗原受体， 可增强NK细胞的特异性识别能 力， 并增强其对叶酸受体α 阳性的结直肠癌细胞系的杀伤能力。 [0007]为达到上述目的， 本发明所采用的技术方案是： 一种靶向叶酸受体α嵌合抗原受说　明　书 1/10 页 3 CN 113896800 A 3