(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202111259942.8 (22)申请日 2021.10.28 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 113699123 A (43)申请公布日 2021.11.26 (73)专利权人 旦旦生物科技 （上海） 有限公司 地址 201205 上海市浦东 新区芙蓉花路5 00 弄2号楼1-2层 (72)发明人 钟莉娉　 (74)专利代理 机构 上海德禾翰通 律师事务所 31319 代理人 夏思秋 (51)Int.Cl. C12N 7/01(2006.01) C12N 15/86(2006.01)C12N 15/40(2006.01) C12N 15/56(2006.01) C12N 15/13(2006.01) A61K 35/768(2015.01) A61K 48/00(2006.01) A61K 38/47(2006.01) A61K 39/395(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (56)对比文件 CN 112626123 A,2021.04.09 审查员 赵二双 (54)发明名称 靶向超敏广谱溶瘤病毒制备及应用 (57)摘要 本发明公开了靶向超敏广谱溶瘤病毒制备 及应用， 所述靶向超 敏广谱溶瘤病毒为一种包含 重组新城疫病毒、 α ‑1,3 GT、 HPSE和FAP  scFv基 因质粒的重组病毒， 所述重组病毒由重组新城疫 病毒NDV‑GHF质粒与辅助质粒共转染BSR细胞拯 救获得。 所述重组新城疫病毒NDV ‑GHF质粒是将 NDV与α‑1,3 GT、 HPSE和FAP  scFv基因进行重组 后的重组新城疫病毒NDV ‑GHF质粒； 所述HPSE基 因、 FAP scFv基因、 α ‑1,3 GT基因的序列分别如 SEQ ID NO:1~3所示。 本发明还公开了上述重组 病毒的制备方法及重组病毒在融化肿瘤物理屏 障中的应用。 权利要求书2页 说明书12页 序列表3页 附图3页 CN 113699123 B 2022.01.25 CN 113699123 B 1.一种包含重组新城疫病毒NDV ‑GHF质粒的重组病毒， 其特征在于， 所述重组病毒由重 组新城疫病毒NDV ‑GHF质粒与辅助质粒共转染BSR细胞拯救获得； 所述重组新城疫病毒NDV ‑ GHF质粒是将新城疫病毒NDV与α ‑1,3 GT、 HPSE和FAP  scFv基因进行重组后的重组新城疫病 毒NDV‑GHF质粒； 所述辅助质粒选自辅助质粒N、 辅助质粒P和辅助质粒L。 2.如权利要求1所述的重组病毒， 其特征在于， 所述新城疫病毒NDV的基因序列见 GenBank FJ766530.1； 所述HPSE基因的序列如SEQ  ID NO:1所示； 所述FAP  scFv基因的序列 如SEQ ID NO:2所示； 所述α ‑1,3 GT基因的序列如SEQ  ID NO:3所示。 3.如权利要求1或2所述的重组病毒在制备融化肿瘤物理屏障的药物中的应用。 4.重组新城疫病毒NDV ‑GHF质粒， 其特征在于， 在新城疫病毒NDV中重组包含α ‑1,3 GT、 HPSE和FAP  scFv基因的重组新城疫病毒NDV ‑GHF质粒； 所述重组新城疫病毒NDV ‑GHF质粒的 载体是TVT/ 071204， 所述α ‑1,3 GT、 HPSE和FAP scFv基因插 入的位点为Age I、 SanD I。 5.如权利要求4所述的重组新城疫病毒NDV ‑GHF质粒， 其特征在于， 所述HPSE基因的序 列如SEQ ID NO:1所示； 所述FAP  scFv基因 的序列如SEQ  ID NO:2所示； 所述α ‑1,3 GT基因 的序列如SEQ  ID NO:3所示。 6.如权利要求4或5所述的重组新城疫病毒NDV ‑GHF质粒在构建包含重组新城疫病毒 NDV‑GHF质粒的重组新城疫病毒中的应用。 7.一种如权利要求1或2所述的重组病毒的制备方法， 其特征在于， 所述方法包括如下 步骤： 步骤一、 构建所述的重组新城疫病毒NDV ‑GHF质粒； 步骤二、 提取测序正确的所述的重组新城疫病毒NDV ‑GHF质粒； 步骤三、 BSR细胞复苏、 换 液、 传代和铺板； 步骤四、 利用痘苗病毒感染BSR细胞， 然后用所述步骤二中提取的重组新城疫病毒NDV ‑ GHF质粒对BSR细胞进行转染； 步骤五、 取 所述步骤四转染后的细胞 上清接种到鸡胚中， 拯救病毒； 步骤六、 从所述 步骤五中的鸡胚中收毒， 检测血凝效价， 确认获得重组病毒。 8.如权利 要求7所述的方法， 其特征在于， 步骤一中， 所述的重组新城疫病毒NDV ‑GHF质 粒的构建方法包括以下步骤： （1） 线性化超敏NDV载体： 用Age  I和SanD I双酶切超敏NDV骨架载体TVT/071204， 回收 载体大片段； （2） 扩增目的基因片段； 所述目的基因的序列如SEQ  ID NO:1~3所示； （3） 将所述步骤 （1） 回收的载体片段与所述步骤 （2） 的目的基因进行同源重组， 连接产 物转化至TransStbl3感受态细胞， 抽提质粒， 通过PCR和Age  I、 SanD I双酶切鉴定获得阳性 重组NDV质粒， 命名为重组新城疫病毒NDV ‑GHF质粒。 9.如权利要求8所述的方法， 其特征在于， 步骤 （2） 中， 所述扩增中引物的序列如下所 示： PF： CCCAAGGTCCAACTCTGTTTAAACTTAGAAAAAATACGGGTAGAAGTGCCACCGACCCCCGGGTCCGCCCG PR： AGGATTGCCGCTTGGGTTTAAACTCATTTGATTTCCACTTTGGTCC。 10.一种静脉注射制 剂， 其特征在于， 所述静脉注射制 剂包括如权利要求1或2所述的重权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 113699123 B 2组病毒。 11.如权利要求1或2所述的重组病毒、 或如权利要求10所述的静脉注射制剂在制备新 城疫病毒 疫苗中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 113699123 B 3