ICS 65. 020. 30 B40 DB64 宁夏回族自治区地方标准 DB 64/ T1638—2019 滩羊纯度PCR-mtDNA鉴定技术操作规程 地方标准信息服务平台 2019 - 02- 12 发布 2019-05-12实施 宁夏回族自治区市场监督管理厅 发布 地方标准信息服务平台 DB64/T1638--2019 前言 本标准的编写格式符合GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的要求。 本标准由宁夏回族自治区农业农村厅提出并归口。 本标准主要起草单位：宁夏农林科学院动物科学研究所、宁夏盐池滩羊产业发展集团、盐池县农牧 局。 本标准主要起草人：马丽娜、马青、王锦、刘永进、于洋、黄玉邦、刘彩凤、吴兰慧、岳彩娟、王 晓薇、侯鹏霞、施安。 地方标准信息服务平台 I 地方标准信息服务平台 DB64/T1638—2019 滩羊纯度PCR-mtDNA鉴定技术操作规程 1范围 本标准规定了滩羊纯度PCR-mtDNACOI基因分子检测方法。 本标准适用滩羊母系纯度PCR-mtDNACOI基因分子检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析试验室用水规格和试验方法 SN/T1193基因检验实验室技术要求 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3. 1 PCR-mtDNA 以线粒体DNA为模版进行聚合酶链式反应（PCR）。PCR-mtDNA分子标记技术主要用于对动物源性成 分检测。基于PCR源性检测的方法操作简便，结果可靠性高。 3. 2 Col（cytochrome oxidase）基因 COI全称为细胞色素c氧化酶亚基I（cytochrome coxidase subunit I），线粒体基因组的13个蛋白 质编码基因，为线粒体内膜呼吸链的组分。由于该基因进化速率较快，常用于分析亲缘关系密切的种、 服务平 亚种及地理种群之间的系统关系。 3. 3 变异位点 对已有参考基因组序列的物种进行个体或群体的全基因组测序序列比对，利用高性能计算平台和生 物信息学方法，检测单核苷酸序列存在插入缺失（InDe1）的位置，从而进行遗传进化分析及重要性状候 选基因预测。 4主要试剂配制及主要仪器设备 1 DB64/T1638—2019 除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682的双蒸水（二级）；高压灭菌条件为1.034 X105Pa压力，蒸汽灭菌20min；基因检验实验室技术要求符合SN/T1193；试验检测需要的主要试剂 配制及主要仪器设备包括： -1%肝素钠溶液：在100ml水中溶解1g肝素钠； TBE缓冲液：10×在700mL水中溶解Tris碱108g、硼酸55g，加入0.5mo1/LEDTA40mL， 加水定容至1L; TBE缓冲液：1×取10×TBE缓冲液100mL，加水定容至1L； TBE缓冲液：0.5×取10XTBE缓冲液加双蒸水稀释50倍； 凝胶成像分析系统； 基因扩增仪； 高速离心机：12000r/min; 稳压稳流电泳仪； 单道可调移液器：2μL，10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL; 电子天平：量程0.001g～100g，感量0.001g； 紫外分光光度计； 恒温震荡器：0r/min～200r/min，0℃～60℃； 电泳槽； 旋涡混合器； 水平电泳槽； 高压灭菌锅：1.4×105Pa～1.6×105Pa； 干燥箱：60℃； 摇床：0r/min～200r/min; ThermoNandrop2000C超微量分光光度仪； 5检测方法 5.1样本采集 每只滩羊颈静脉采血量为2mL～5mL，1%肝素钠抗凝（每6mL新鲜血液中加入1mL肝素钠溶液）。 采血后，颠倒混匀，-20℃冻存。 5.2DNA提取 冷冻血液在室温融化后，使用天根全血基因组DNA提取试剂盒（DP318）提取，24h后置于-20℃ 保存。 5.3DNA检测 取2μLDNA溶液置入微量离心管中，用水稀释100倍。在紫外分光光度计260nm和280nm测 定OD值。DNA浓度（μg/μL）=OD260值×10；DNA纯度=OD260值／OD280值。纯DNA的OD260/OD280比值应为1.8， 若比值大于1.8，说明有RNA存在，应用RNA酶处理样品；若小于1.8，说明样品中含有蛋白质和酚，应 再用酚/氯仿抽提，以乙醇沉淀纯化DNA。 5.4引物序列 2 DB64/T1638—2019 根据已发表的羊mtDNA全序列（GenBank序列登录号为AF533441）用Primer5设计用于扩增COI基因的 特异性引物，PCR引物为：F：5'-TTAATTCACTACAGGACCTGGTAA-3'，R：5’-GTGGCTATGGTGTTGGCTT-3'。 5.5PCR扩增 5.5.1PCR扩增体系 PCR反应体系为50uL:PCRMIX25uL,DNA（50ng/uL)2.5uL，F(10umol/uL)2.5uL,R(10umo1/uL) 2.5 uL, ddH20 17.5 uL. 5.5.2PCR扩增循环参数 PCR反应程序为：95℃3min，94℃30S，58℃35s，72℃50S，30个循环，72℃延伸 10min，4℃保存。也可根据不同的基因扩增仪对PCR扩增循环参数做适当调整。 5.5.3PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测 引物的PCR产物都用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。 5.5.3.11.5%琼脂糖凝胶制备 琼脂糖凝胶制备需要的装置有胶版、隔板、一次性手套、微波炉、三角瓶和多齿梳子等。先用水清 洗制胶板，再用0.5×TBE冲洗一次，水平放置；称取琼脂糖0.6g，溶解于40mL0.5×TBE中；微波 炉加热煮沸，取出后室温放置降温，待温度降至约55℃时加入15μL溴化乙锭并混匀；将混合液缓 慢倒入制胶板中，排除气泡，插入多齿梳子；约20min后胶液凝固，拔出梳子后将凝胶转移至水平电 泳槽中；往电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。 5.5.3.2PCR产物检测 6μL扩增产物加1μL上样缓冲液（6XDNALoadingBuffer），DNAMarkerI（0.05mgDNA/mL） 用量为4μL。3V/cm～5V/cm恒压，电泳20min～30min；用凝胶成像仪观察并分析记录。 5.6PCR产物回收 利用天根(DP203-01)PCR产物纯化试剂盒回收后的送上海生工进行双向测序。 标准信息 6结果判定 6.1绵羊血液全基因组DNA提取 采用DNA提取试剂盒从采集的绵羊冷冻血中提取基因组DNA，通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，显 示所提取的基因组DNA含蛋白质较少，并通过ThermoNandrop2000C超微量分光光度仪检测每μuL约含DNA 50ng左右，结果表明提取的基因组DNA无降解，证实DNA含量和纯度满足本试验的要求，绵羊血液全基 因组DNA琼脂糖凝胶电泳图见附录A.1。 6.2PCR扩增产物检测 将PCR扩增产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测COI基因扩增产物长度1279bp，结果见附录A.2,则表 示扩增特异性好，可进行下一步检测。 6.3细胞色素c氧化酶(CO1)基因的序列分析 3