ICS65.020 CCSB05DB6108 榆林市地方标准 DB6108/T56—2023 马铃薯脱毒试管苗生产技术规程 2023-06-02发布 2023-07-02实施 榆林市市场监督管理局发布 DB6108/T56—2023 1 DB6108/T56—2023 I前  言 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 本文件由榆林市农业农村局提出并归口。 本文件起草单位：榆林市农业科学研究院、定边县科发马铃薯良种繁育有限责任公司。 本文件主要起草人：张艳艳，张春燕，童霄丽，方玉川，杜清荣，张媛媛，白艳艳，拓小波，张强， 陈丽娟，李东东，薛伟，薛皎，闫陆飞，高慧，王毛毛，韩芬，付永飞，朱继宇，贺海军，王彦 梅，胡晓燕，白延生，乔文渊，李小娟，张蓉蓉，刘小林。 本文件由榆林市农业科学研究院负责解释。 本文件为首次发布。 联系信息如下： 单位：榆林市农业科学研究院 电话：0912-3359657 邮箱地址：[email protected] 地址：陕西省榆林市榆阳区上郡南路14号 邮编：719000 DB6108/T56—2023 1马铃薯脱毒试管苗生产技术规程 1范围 本文件规定了马铃薯脱毒试管苗生产的车间建设、脱毒流程、试管苗繁育、档案建立。 本文件适用于榆林市马铃薯脱毒试管苗生产。 2规范性引用文件 下列文件对本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB3095环境空气质量标准 GB/T29375-2012马铃薯脱毒试管苗繁育技术规程 GB50073-2001洁净厂房设计规范 NY/T401-2000脱毒马铃薯种薯(苗)病毒检测技术规程 3术语和定义 GB/T29375—2012规定的术语和定义适用于本文件。 4生产车间建设 4.1立地条件 选址可按照GB50073-2001中4.1的规定执行，宜建在供电稳定、四周空气流通较好，自然光源充足， 没有空气污染和水源污染的地域。 4.2车间布局 4.2.1车间布局可按照GB50073-2001中4.2的规定执行。 4.2.2须配备配制室、灭菌室、清洗室、更衣室、预制室、接种室、培养室等。配制室、灭菌室、清 洗室与更衣室、预制室、接种室、培养室等应绝对隔离。 4.3卫生要求 4.3.1空气质量不低于GB3095中对总悬浮颗粒物（TSP）二级要求。 4.3.2生产车间要保持干净、清洁，接种室和培养室应定期消毒，消毒要求如下： a)大消毒。1次/月，每m³空间用40%甲醛溶液5mL+高锰酸钾5g混合熏蒸。密闭3d后，再通风 1d； b)日常消毒。1次/d，接种室接种前一天晚上用50mg/LClO2熏蒸。 5脱毒流程 5.1培养基制备 DB6108/T56—2023 25.1.1培养基配制：在MS基本培养基（见附录A）中按照不同比例添加NAA、6-BA、GA3及D-泛酸钙 等植物生长调节剂，并分装于培养瓶中。 5.1.2培养基消毒：培养瓶加盖后置于高压蒸汽灭菌锅121℃条件下灭菌20min。 5.2剥离材料的选择和处理 5.2.1选择：在生长季节选择具有品种典型性状的健康单株，收获后选取健康块茎。 5.2.2处理：块茎通过自然休眠或者激素处理后，在室温内进行先暗光后散射光的催芽处理。 5.3茎尖剥离 5.3.1无菌工作条件创造 5.3.1.1组培室用4.3.2的方法消毒后，再用紫外线灯照射40min。 5.3.1.2无菌操作台要提前2h打开风机和紫外灯杀菌。 5.3.1.3工作人员用硫磺皂洗手，75%酒精擦拭消毒。 5.3.1.4操作器具在高压蒸汽灭菌锅内121℃条件下灭菌20min，置于无菌操作台上备用。 5.3.2病毒钝化 5.3.2.1物理钝化：将马铃薯薯块在36℃条件下处理4周～6周或用紫外线照射脱毒材料10min。 5.3.2.2化学钝化：在培养基中加入病毒唑，使病毒钝化失活。 5.3.3茎尖消毒 经催芽处理，待芽萌发至2cm～3cm时，选取健壮芽，用解剖刀切下，芽段用自来水冲洗40min以 上，再用75%的酒精浸蘸30s，放入无菌杯内用6%的次氯酸钠溶液浸泡10min，最后用无菌水冲洗3 次。 5.3.4茎尖剥离及接种 将茎尖放在无菌滤纸上吸干水分，在10倍解剖镜下用解剖针剥取带1个～2个叶原基的茎尖（0.1mm～ 0.3mm），迅速按无菌操作程序接入培养基中。 5.4茎尖培养 温度20℃～25℃，光照强度2000Lx～3000Lx，光照时间16h/d，培养90d～140d。当看到明显生长的 小茎，叶原基形成可见的小叶，转入无生长调节剂的培养基中。小苗继续生长并形成根系，发育成3个～ 4个叶片的小植株，即可继续扩繁。 5.5病毒检测 以单株为系进行扩繁，苗数达150株～200株时，随机抽取3个～4个样本，每个样本10株～15株，进 行病毒检测，采用NY/T401中的酶联免疫吸附试验法(ELISA)和RT-PCR法检测确认不带有PVX、PVY、PVS、 PLRV、PVA、PVM和PSTVd。 5.6脱毒苗试种 病毒检测合格的试管苗在网棚中用无土栽培的方式进行试种，与大田种植的同品种马铃薯植株和块 茎的各个指标进行比对： a)苗期观察植株叶片形状、颜色，茎秆颜色以及花色、花型等指标。