ICS 65.150 B 52 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 7212.1—2011 鲤疱疹病毒检测方法 第1部分：锦鲤疱疹病毒 Detection methods of cyprinid herpesvirus(CyHv)-- Part 1 : Koi herpevirus 行业标准信息服务平台 2011-09-01 发布 2011-12-01实施 中华人民共和国农业部 发布 SC/T 7212. 1—2011 前 言 SC/T7212—2011分为三个部分： 第1部分：锦鲤疱疹病毒； 第2部分：鲤痘疮病毒； 第3部分：金鱼造血器官坏死病毒。 本部分为SC/T7212—2011的第1部分。 本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些部分可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由中华人民共和国农业部渔业局提出。 本部分由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。 本部分起草单位：中国水产科学研究院珠江水产研究所、广东出入境检验检疫局、广州市兴达动物 药业有限公司。 本部分主要起草人：谭爱萍、叶星、姜兰、赵飞、邹为民、林志雄、陆小苕、乌日琴、简清、陈信廉。 行业标准信息服务平台 I SC/T 7212. 1—2011 鲤疱疹病毒检测方法 第1部分：锦鲤疱疹病毒 1范围 本部分规定了锦鲤疱疹病毒(Koi herpevirus,KHV)的采样程序、病毒鉴定方法与结果判定指标。 本部分适用于锦鲤疱疹病毒的检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出人境动物检疫采样 SC/T7014—2006水生动物检疫实验技术规范 3术语和定义 下列术语和定义适用于本部分。 3. 1 锦鲤疱疹病毒Koi herpevirus,KHV 锦鲤疱疹病毒，又称鲤疱疹病毒3型（CyHV-3)，是一种双链DNA病毒，其直径为170nm～230 nm，含有31个病毒多肽，具有核心、衣壳和囊膜结构 4试剂和材料 4.1水 符合GB/T6682中一级水的要求。 2阳性对照 4. 2 阳性对照为已知受KHV感染，且PCR检测结果为锦鲤疱疹病毒阳性的DNA模版。 4.3阴性对照 阴性对照为已知未受KHV感染，且PCR检测结果为锦鲤疱疹病毒阴性的DNA模版。 4.4空白对照 灭菌双蒸水(无DNA酶)。 4.5无水乙醇 4.6十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) 4.7Taq DNA聚合酶 TagDNA聚合酶或EαTaqDNA聚合酶,生化试剂，一20℃保存。 4.8dNTPs混合物 含dATP、dTTP、dCTP、dGTP各25mmol/L的混合物，一20℃保存。 4.9引物 1 SC/T 7212. 1--2011 5'-CAC-CCA-GTA-GAT- TAT-GC- 3。 锦鲤疱疹病毒Sph基因扩增引物,P3:5'-GAC-ACC-ACA-TCT-GCA-AGG-AG-3',P4:5' GAC- ACA - TGT- TAC- AAT- GGT-CGC- 3'。 4.10矿物油 要求无DNA酶，用于无热盖的PCR扩增仪。 4.11DNA 分子量标准 推荐使用DNAladder100，各片段大小依次为：1500bp，1000bp，900bp800bp，700bp，600bp， 500bp，400bp，300bp，200bp，100bp。也可使用其他合适的DNA分子量标准。 4.12核酸凝胶染色剂 溴化乙啶（EB)或其他EB替代品。 5仪器与设备 5.1PCR扩增仪 5.2水平电泳仪 输出直流电压0V~600V。 5.3紫外观察灯或凝胶成像仪 5.4离心机 最高转速可达12000r/min以上。 5.5普通冰箱 5.6组织研磨器 5.7微量移液器 6采样 6.1采样数量 按SC/T7014--2006中6.1的规定执行。 6.2个体要求 活的或刚死不久的鱼。 6.3采样部位 有临床症状的鱼，如体长不超过4cm，取整条鱼；体长为4cm～6cm，取内脏（包括肾）；体长大于6 cm，则取脑、肝、肾、脾和鳃组织。 无症状的鱼取肾、脾、鳃和脑组织。 性成熟雌鱼还需取卵巢液。 7 KHV 的 PCR检测 7.1 DNA 抽提 7.1.1取100mg待检新鲜组织与300μLCTAB溶液（A.1)研磨匀浆,置于1.5mL离心管内。加人 450μLCTAB溶液并混匀，25℃放置2h。 7.1.2加人600uL酚-三氯甲烷-异戊醇（A.2)至样品离心管中，用力混合至少30s，12000r/min离心 5min，小心取上层水相（约800μL)置于新的1.5mL离心管中。 7.1.3加人700uL三氯甲烷-异戊醇（A.3），用力混合至少30s，12000r/min离心5min，小心取上层 水相（约600μL)置于新的1.5mL离心管中。 2 SC/T 7212. 1—2011 7.1.4加人一20℃预冷的1.5倍体积的无水乙醇（约900uL），倒转数次混匀后，置-20℃沉淀8h以 上。 7. 1. 5 12000r/min离心30min，小心弃上清，倒置于吸水纸上吸干水分；37℃干燥20min或抽真空干 燥。 7.1.6加10μL无菌双蒸水溶解，作为DNA模板。 DNA抽提也可选用商品化DNA抽提试剂盒，按相应说明书提供的方法予以抽提。 7.2基因扩增 7.2.1TK 基因扩增 7.2.1.1按表1加人除TagDNA聚合酶以外的各项试剂，配成无酶反应预混物。 表110份TK基因PCR反应预混物所需试剂组成 50μL体系 100 μL体系 试剂终浓度 10×TagPCR缓冲液（无Mg+） 100 μL 200 μL 2X MgCl2 (25 mmol/ L) 50 μL 100 μL 2. 5 mmol/ L dNTPs(25 mmol/ L) 5 μL 10 μL 各 0. 25mmol/L 10 μL 引物P1(100 pmol/μL) 5 μL 1 pmol/ μL 引物P2(100 pmol/μL) 5 μL 10 μL 1 pmol/ μL 无菌双蒸水(无DNA酶) 307. 5 μL 615 μL Taq DNA 聚合酶(5 U/μL) 2. 5 μL 5 μL 0. 025 U/μL 475 μL 10份反应总体积（无DNA模板） 950 μL DNA模板的使用体积与实际提取样品的DNA浓度有关，需根据实际情况进行调整，并用无菌双蒸水（无DNA酶)的 增加或减少至终体积。 7.2.1.2将无酶反应预混物按10份/支或100份/支分装，保存于一20℃。在临用前，根据所需的反应 份数，取出无酶反应预混物，加入相应体积的TagDNA聚合酶，混匀，即成完全反应预混物。 的样品DNA模板(0.1μug～2ug）。如果使用无热盖的PCR扩增仪，需在反应混合物上滴加2滴矿物 油。混匀后3000r/min离心30s。 延伸1min，40次循环；72℃延伸10min;4℃保温。 7.2.2Sph基因扩增 7.2.2.1按表2,加人除EαTaqDNA聚合酶以外的各项试剂,配成无酶反应预混物。 表210份Sph基因PCR反应预混物所需试剂组成 20μL体系 100μL体系 试剂终浓度 10XExTaqPCR缓冲液 20 μL 100 μL 1X dNTPs(25 mmol/ L) 1. 6 μL 8 μL 各 0. 2 mmol/ L 引物P3(100 pmol/μL) 2 μL 10 μL 0. 5 pmol/ μL 引物P4(100pmol/μL) 12ml 10 μL 0. 5 pmol/ μL 无菌双蒸水(无DNA酶) 163. 4 μL 817 μL Eα Taq DNA 聚合酶(5 U/μL) 1 μL 5 μL 0. 025 U/μuL 10份反应总体积（无DNA模板） 190 μL 950μL DNA模板的使用体积与实际提取样品的DNA浓度有关，需根据实际情况进行调整，并用无菌双蒸水（无DNA酶)的 增加或减少至终体积。 7.2.2.2按7.2.1.2的方法配制含EcTagDNA聚合酶完全反应预混物。 7.2.2.3按7.2.1.3的方法加人样品DNA模板及离心。 3 SC/T 7212. 1—2011 7.2.2.4将上述PCR管置于PCR扩增仪。94℃预变性30s;94℃变性30s、63℃退火30s、72℃延伸 30s，40次循环；72℃延伸7min；4℃保温。 7.3琼脂糖凝胶电泳 用电泳缓冲液TBE(A.4)配制2%的琼脂糖（含0.5μg/mLEB或相应浓度的EB替代品）)平板，凝 固后放人水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将上述8μL混合有上样缓冲液（A.5)的PCR产物 加人样品孔，使用DNA分子量标准作对照。120V电泳约20min，于紫外光下观察电泳片段的数量和 位置。 7.4核酸测序 将PCR产物做核酸序列测定，测序结果与已知序列进行比较。 7.5结果判断 7.5.1琼脂糖凝胶电泳 7.5. 1. 1 TK 基因 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，阳性对照出现一条约409bp的DNA片段，阴性对照和空白对照 没有此DNA片段。待检样品出现一条约409bp的DNA片段则判定为阳性。 7.5.1.2Sph 基因 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，阳性对照出现一条约292bp的DNA片段，阴性对照和空白对照 没有此DNA片段。待