ICS 59.140.20 X 45 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3307—2018 动物毛纤维源性成分鉴定 实时荧光定性PCR法 Identification of animal-derived materials in wool fibers- QualitativerealtimePCR method 行业标准信息服务平台 2018-12-19发布 2019-06-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T3307—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由农业农村部畜牧兽医局提出。 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274）归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院生物技术研究中心。 本标准主要起草人：张全芳、刘艳艳、范阳阳、胡悦、马德源、王俊燕、李燕、杨雪、谭晴晴、陈雪燕、刘 国霞、步迅、王兴军。 行业标准信息服务平台 I NY/T3307—2018 动物毛纤维源性成分鉴定 实时荧光定性PCR法 1范围 本标准规定了对水貂、狐狸、兔、骆驼、山羊、绵羊、鸭和鹅8种动物毛纤维源性成分进行鉴定的实时 荧光定性PCR法。 本标准适用于动物毛纤维中水貂、狐狸、兔、骆驼、山羊、绵羊、鸭和鹅8种源性成分的定性检测。 本方法检出限为1%。 2规范性引用文件 RD 下列文件对于本文 注日期的版本适用于本文 F本件 件。凡是不注日期的 可括所有的修改单 分析实验空用水规格和试验方法 GB/T 6682 验全质 GB/T2740 量控制规剂 食品分子生 物学检 S 3术语和定义 下列术语 义适用 利和 本文件 3. 1 R 实时荧光PCR 在PCR反应 系中力 人费光基内，利用荧 号积累实时监控整个PCR 来知模板进行定 性或定量分析 3. 2 荧光信 的阅值时所经历的循环数 每个反应管内的 GR 4原理 不物种间保守区设计通用引物。 可变 根据线粒体16S 基因 十物种特异性探针， CON 采用TaqMan实时荧光PCR技术进行增 灵据PCR扩增反应的荧光信号 循环阈值，判定水貂、狐 狸、兔、骆驼、山羊、绵羊、鸭和鹅8种动物源 数分。 5试剂或材料 除另有规定外，仅使用分析纯试剂。 5.1水，GB/T6682，—级。 5.21mol/LTris-HCl(pH6.4)溶液：称取12.1gTris置于100mL烧杯中，加人80mL水，用浓 HCl调节pH至6.4，加水定容至100mL，103.4kPa蒸汽压(121℃)灭菌20min，室温保存待用。 5.31mol/LTris-HCl(pH8.0溶液：称取12.1gTris置于100mL烧杯中，加人80mL水，用浓 HCl调节pH至8.0,加水定容至100mL，103.4kPa蒸汽压（121℃）灭菌20min，室温保存待用。 5.40.5mol/LEDTA（pH8.0）溶液：称取18.61gNazEDTA·2HzO置于100mL烧杯中，加入 80mL水，用10%的NaOH溶液，调节pH至8.0，加水定容至100mL，103.4kPa蒸汽压（121℃)灭菌 20min，室温保存待用。 1 NY/T3307—2018 5.510%十二烷基硫酸钠（SDS)溶液：称取10gSDS溶解于80mL无菌水中，加水定容至100mL。储 存于灭菌过的容器中待用。 5.65mol/LNaCl溶液：称取29.22gNaCl溶解于80mL无菌水中，加水定容至100mL，103.4kPa 蒸汽压（121℃）灭菌20min，室温保存待用。 5.7细胞裂解液(LysisBuffer)：取1mol/LTris-HCl(pH8.0）溶液20mL,0.5mol/LEDTA(pH 8.0）溶液5mL，5.0mol/LNaCl溶液10mL，10%SDS溶液5mL，加水定容至100mL，混匀。 5.820mg/mL蛋白酶K溶液：准确称量0.2g蛋白酶冻干品，加无菌水溶解，加水定容至10mL，分装 后于一20℃保存。 5.9RNA酶溶液：将1g冻干品RNA酶A溶解于6mL无菌水中，于100℃加热15min，缓慢冷却至 室温，加水定容至10mL，分装成小份存于一20℃。 5.101mol/L二硫苏糖醇(DTT)：准确称量1.543gDTT,加人6mL水溶解，加水定容至10mL，分 装后于一20℃保存。 5.115%Chelex-100树脂：称取5gChelex-100树脂，溶解于100mL水中。 5.12硅珠悬浮液：取5g的硅胶加人到20mL的水中充分混合，静止24h，弃掉上清液，然后再加人 酸，充分混合，调节pH至2.0。 5.13DNA结合液（BindingBuffer）：称取60g异硫氰酸胍（GUSCN)，加人5mL1mol/LTris-HCl (pH6.4)溶液，再加人8mL0.5mol/LEDTA（pH8.0）溶液，再加人4mL聚乙二醇辛基苯基醚（Tri tionX-100）（温度在60℃），加水定容至100mL。 再加人8mL0.5mol/LEDTA（pH8.0）溶液，加水定容至100mL。 5.1570%乙醇：量取70mL无水乙醇，加人30mL水。 5.16TE缓冲液：将0.5mL的10mmol/LTris-HCl(pH8.0)溶液、0.1mL的0.5mol/LEDTA (pH8.0)溶液加人到50mL容量瓶中，调pH8.0,加水定容，103.4kPa蒸汽压（121℃)灭菌20min，降 至室温，4℃保存备用。 5.17洗毛剂：取100mL5%的原液，加水900mL。 5.18水貂、狐狸、兔、骆驼、山羊、绵羊、鸭和鹅8种动物源性成分实时荧光PCR检测试剂盒试剂：2X TaqManMasterMix，含有TaqDNA聚合酶（终浓度1U/20μL）、Mg2+（终浓度2.0mmol/μL）、dNTPs 准信息服务平台 （终浓度0.2mmol/μL）。水貂、狐狸、免、骆驼、山羊、绵羊、鸭和鹅8种动物源性基因组DNA阳性标 准品。 6仪器设备 6.1实时荧光定量PCR仪：4通道以上。 6.2紫外分光光度计：波长190nm~900nm。 6.3分析天平：感量0.1mg。 6.4离心机：最大转速13000g。 6.5振荡型恒温金属浴：0℃~100℃。 6.6高压灭菌锅。 6.7冰箱：-20℃~4℃。 6.8超净工作台。 2 NY/T3307—2018 7检测用引物和探针 内参引物探针序列及水貂、狐狸、兔、骆驼、山羊、绵羊、鸭和鹅8种动物的通用引物和特异性探针序 列见附录A中的表A.1。引物探针在序列中的位置参见附录B。 8试验步骤 8.1取样 从毛纤维制品的不同部位共取约1g试样， 发样整理成束，置于含0.5%洗毛剂（5.17）的水 特百 中，用超声波清洗干净。再用蒸馏水冲洗多次，至无泡沫。在无水乙醇中浸泡5min，真空干燥。用剪刀 将样品剪碎，再加液氮研磨成粉不 8.2DNA提取 称取3mg粉末至 mL （5.7）、10μL蛋白酶 浴液（5 8和10 OTTC 放置 全部裂解 解3h~5h，直至毛 离心3min，取上 helex 对胎 DNA结合液 清液至新1.5mL离心 营中加人10正佳珠县浮液（5 3），充分混匀，静 14).涡旋振离使沉淀悬浮，8000g离 置5min，8000g离心 1min，奔去生清液 加人7 漂洗液 加 心1min，弃去 700L70251 5洗涤：8900 50TL Ds吸走残余液体，室温干燥10 待4醇完全挥发加 TE缓冲液 次。8000g离 加灯RNA酶浴液37 miY,吸 （5.16)溶解DNA 1m.8000g离心 取上 清液转移至 新离心管中， C保荐备 吸光值 用紫外分光光 OD260/OD280比 工 值在1.7~1.9范 包围内·试验用DNA 度在ng ~50ngl CEN 注：可采用经验 正的动物组织DNA提取试剂盒，技 8.3实时荧光PCR反应 光PCR检测 8.3.1试样实时荧 8.3.1.1多重实 光PC 1组包括水貂、 种~3种动物源 狐狸和兔；B组包括骆 性的特异探针，并加 8.3.1.2单重实时荧光PCR:8种动 光PCR反应体系D见表 8.3.2对照实时荧光PCR反应体系 在试样PCR反应的同时，设置如下阴性对照、空白对照和阳性对照 阴性对照：以8种动物之外的动物基因组DNA为 b) 空白对照：以水作为空白对照； c) 阳性对照：将水貂、狐狸、兔、骆驼、山羊、绵羊、鸭和鹅8种动物基因组DNA等量混匀作为阳性 对照。 注：每个PCR反应设置3次平行。 8.3.3实时荧光PCR反应体系配制 分别按照表A.2、表A.3、表A.4和表A.5依次加人试剂，配制PCR反应体系，混匀离心分装至 PCR反应管中，加人模板DNA，3000g离心1min，取出PCR管，放人荧光定量PCR仪中。 8.3.4实时荧光PCR反应程序 95℃预变性3min；95℃变性10s，62℃退火延伸35s（收集荧光信号），40个循环。 3 NY/T 3307—2018 9试验数据处理 9.1对照检测结果分析 空白对照、阴性对照和阳性对照全部满足下述条件，表明PCR体系有效： a）空白对照：A、B、C、D4组PCR体系对应的反应孔均无FAM、JOE、CY3和CY5荧光的典型扩 增曲线； b) 阴性对照：A、B、C、D4组PCR体系对应的反应孔均无FAM、JOE、CY3荧光的典型扩增曲 线；而CY5有典型扩增曲线，且Ct值≤35.0； c） 阳性对照：A、B、C、D4组PCR体系对应的反应孔中均出现FAM、JOE、CY3和CY5荧光的典 型扩增曲线，且Ct值≤35.0