ICS 65.020.01 B 05 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T2640—2014 植物源性食品中花青素的测定 高效液相色谱法 Determination of anthocyanidins in plant origin products- High performance liquid chromatography 行业标准信息服务平台 2014-10-17发布 2015-01-01实施 中华人民共和国农业部 厂发布 NY/T 2640—2014 前言 本标准按照GB/T1.1—2009和GB/T20001.4——2001给出的规则起草。 本标准由农业部种植业管理司提出并归口。 本标准起草单位：四川省农业科学院分析测试中心、农业部食品质量监督检验测试中心（成都）、浙 江省农业科学院农产品质量标准研究所。 本标准主要起草人：胡莉、雷绍荣、郭灵安、毛建霏、仲伶俐、杨晓凤、侯雪、郑蔚然。 行业标准信息服务平台 I NY/T2640—2014 植物源性食品中花青素的测定高效液相色谱法 1范围 本标准规定了植物源性食品中的飞燕草色素、矢车菊色素、矮牵牛色素、天竺葵色素、芍药素和锦葵 色素共6种花青素的高效液相色谱测定方法。 本标准适用于植物源性食品中花青素含量的测定。 本标准的检出限：以称样量为1g，定容体积为50mL计，飞燕草色素、矢车菊色素、天竺葵色素、芍 药素和锦葵色素5种花青素的检出限均为0.15mg/kg；矮牵牛色素的检出限为0.5mg/kg。同样条件 下定量限：飞燕草色素、矢车菊色素、天竺葵色素、芍药素和锦葵色素5种花青素均为0.5mg/kg；矮牵 牛色素为1.5mg/kg。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义 GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3原理 植物源性食品中的花青素主要以花色苷的形式存在。试样经乙醇一水的强酸溶液超声提取花色苷 后，经沸水浴将花色苷水解成花青素，用高效液相色谱法测定，以保留时间定性，外标法定量。 4试剂和材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。水为GB/T6682规定的一级水。 4.1无水乙醇(CzH,OH)：色谱纯。 4.2甲酸（CH2O2）：色谱纯。 4.3甲醇(CH3OH):色谱纯。 4.4盐酸(HCI)：优级纯。 4.5提取液：无水乙醇+水+盐酸=2+1+1(V+V+V)，取200mL无水乙醇、100mL水和100mL 盐酸混匀。 4.610%盐酸甲醇溶液（体积比）：取10mL盐酸、90mL甲醇混匀。 4.7飞燕草色素（Delphinidin）：CAS号528-53-0纯度≥96%。 4.8车菊色素（Cyanidin）：CAS号528-58-5，纯度≥98%。 4.9矮牵牛色素（Petunidinchloride）：CAS号1429-30-7，纯度≥96%。 4.10天竺葵色素（Pelargonidin）：CAS号134-04-3，纯度≥96%。 4.11药素（Peonidin）：CAS号134-01-0,纯度≥98%。 4.12锦葵色素（Malvidin）：CAS号643-84-5，纯度96%。 4.13单标储备溶液 1 NY/T2640—2014 分别准确称取飞燕草色素（Delphinidin）矢车菊色素（Cyanidin）、矮牵牛色素（Petunidinchloride）、 天竺葵色素（Pelargonidin）、芍药素（Peonidin）和锦葵色素（Malvidin）共6种花青素标准品5.0mg，用 10%盐酸甲醇溶液（4.6)溶解并分别定容至10mL容量瓶中，即为500mg/L的单标储备液，于一18℃ 下，贮存于密闭的棕色玻璃瓶中，保存有效期为6个月。 4.14混合标准使用液 在使用中将单一标准储备液进行混合后，用10%盐酸甲醇溶液（4.6)作为溶剂，并逐级稀释成0.5 mg/L、1.0mg/L、5.0mg/L、25.0mg/L、50.0mg/L或其他浓度的花青素混合标准使用液。在4℃条 件下，有效期为6个月。 4.15滤膜：0.45um，水相滤膜。 5仪器与设备 5.1高效液相色谱仪带 紫外或二极管阵列检测器。 5.2天平：精度0.01mg，0.01g。 5.3水浴锅：精度土2℃。 5.4匀浆机。 5.5超声波清洗机。 5.6粉碎机。 6分析步骤 6.1试样制备 采用四分法分取样品，含水率高的样品，如葡萄、茄子等，取约200g于匀浆机中匀浆；含水率低的 样品，如黑米、黑豆等，用粉碎机进行粉碎，过250um的筛。所有样品在一18℃条件下保存。 6.2提取 根据样品中花青素含量，称取样品1.00g~10.00g于50mL具塞比色管中，加入提取液（4.5）定容 至刻度，摇匀1min后，超声提取30min。 6.3水解 超声提取后，于沸水浴中水解1h，取出冷却后，用提取液（4.5）再次定容。静置，取上清液，用0.45 um水相滤膜过滤，待测。样品制备好后，在4℃条件下，保存时间不超过3d。 6.4测定 6.4.1色谱参考条件 色谱柱：C1s柱，250mm×4.6mm×5um或性能相当者， 流动相A为含1%甲酸水溶液，流动相B为含1%甲酸乙睛溶液 c) 检测波长：530nm； (P 柱温：35℃； e) 进样量：20uL； f) 梯度洗脱条件.见表1。 表1梯度洗脱表 时间，min 流速，mL/min 流动相A,% 流动相B,% 0. 0 0.8 92.0 8.0 2.0 0.8 88.0 12.0 2 NY/T2640—2014 表1 (续) 时间，min 流速，mL/min 流动相A% 流动相B,% 5. 0 0. 8 82.0 18.0 10.0 0.8 80.0 20.0 12.0 0. 8 75.0 25.0 15.0 0. 8 70.0 30.0 18.0 0.8 55.0 45.0 20.0 0.8 20.0 80.0 22.0 0.8 92.0 8.0 30.0 0. 8 92.0 8.0 6.4.2色谱分析 分别将标准溶液和试样溶液，注人液相色谱仪中，以保留时间定性，以样品溶液峰面积与标准溶液 峰面积比较定量。色谱图参见附录A。 7结果计算 样品中花青素含量为6种花青素含量之和。其含量以质量分数w计，单位为毫克每千克（mg/ kg）,按式(1)计算。 pxv w= (1) 式中： 0一—待测液中各花青素的质量浓度，单位为毫克每升（mg/L)； V一一定容体积，单位为毫升(mL)； m一一试样质量，单位为克(g)。 测定结果取两次测定的算术平均值，计算结果保留三位有效数字。 8精密度 本标准精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的，获得重复性和再现性的 值是以95%的置信度来计算。本标准方法的精密度数据参见附录B。 标准信息服务平台 3 NY/T 2640—2014 附 录 A (资料性附录） 标准溶液色谱图 2.0μg/mL花青素标准溶液色谱图见图A.1。 30 20 10 0 10 15 20 25 30 0 5 保留时间（min） 说明： 一飞燕草色素； 4——天竺葵色素； 2矢车菊色素； 5——药药素； 3——矮牵牛色素 6——锦葵色素。 图A.12.0μg/mL花青素标准溶液色谱图（2530nm） 业标准信息服务平台 NY/T2640—2014 附 录 B (资料性附录) 方法精密度 方法精密度见表B.1。 表 B. 1 方法精密度 含量 含量 含量 参数 R 参数 R 参数 r r R mg/ kg mg/ kg r mg/ kg 矮牵牛 2. 5 0. 74 0. 84 矮牵牛 5. 0 1. 62 1. 73 矮牵牛 10. 0 1.77 2.25 矮牵牛 25.0 6. 86 7. 95 矮牵牛 50.0 9. 03 14.44 矮牵牛 100.0 18. 47 27.27 飞燕草 2. 5 0. 61 0. 69 飞燕草 5. 0 0.96 1. 17 飞燕草 10.0 1. 79 2. 41 飞燕草 25.0 5. 82 6.56 飞燕草 50.0 9. 35 11.40 飞燕草 100.0 22.18 23.76 锦葵素 2.5 0. 51 0.70 锦葵素 5. 0 1. 04 1. 58 锦葵素 10. 0 2.23 3.18 锦葵素 25.0 7. 51 13. 33 锦葵素 50.0 13.04 15.99 锦葵素 100.0 24.46 28.37 芍药素 2. 5 0. 47 0.53 芍药素 5. 0 1. 16 1. 70 芍药素 10. 0 1. 4 2.60 芍药素 25.0 8. 00 7. 95 芍药素 50.0 14.65 19.97 药药素 100.0 21.51 35.09 天竺葵 2. 5 0.54 0. 61 天竺葵 5.0 1, 71 2. 39 天竺葵 10.0 2. 11 2.57 天竺葵 25.0 8. 46 8.65 天竺葵 50.0 14.25 17.20 天竺葵 100.0 23.41 27.72 矢车菊 2. 5 0. 70 0. 87 矢车菊 5. 0 1.85 1. 92 矢车菊 10. 0 1. 97 2.5 矢车菊