ICS67.120.10 CCSX22DB36 江西省地方标准 DB36/T1881—2023 黑斑侧褶蛙米尔伊丽莎白菌分离鉴定技术 规范 TechnicalspecificationforisolationandidentificationofElizabethkingiamiricolain Rananigromaculata 2023-11-20发布 2024-05-01实施 江西省市场监督管理局发布 DB36/T1881—2023 I目  次 前言......................................................................................................................................................................II 1范围.................................................................................................................................................................1 2规范性引用文件............................................................................................................................................1 3术语与定义....................................................................................................................................................1 4设备和材料....................................................................................................................................................1 5培养基和试剂配制........................................................................................................................................2 6分离与鉴定技术流程....................................................................................................................................2 7操作步骤........................................................................................................................................................2 8回归感染........................................................................................................................................................4 9菌种保存及生物安全....................................................................................................................................4 附录A（资料性附录）设备和材料..............................................................................................................5 附录B（资料性附录）培养基和试剂配制..................................................................................................6 DB36/T1881—2023 II前  言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。 本文件的某些内容有可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由江西省农业农村厅提出并归口。 本文件起草单位：江西省农业科学院畜牧兽医研究所、南昌大学、江西省农业技术推广中心。 本文件主要起草人：刘文舒、郭小泽、王玉柱、李思明、简少卿、李小勇、陈彦良、唐艳强、肖海 红。 DB36/T1881—2023 1黑斑侧褶蛙米尔伊丽莎白菌分离鉴定技术规范 1范围 本文件规定了黑斑侧褶蛙米尔伊丽莎白菌分离鉴定的设备和材料、培养基和试剂配制、分离与鉴定 技术流程、操作步骤、回归感染和菌种保存及生物安全。 本文件适用于黑斑侧褶蛙米尔伊丽莎白菌分离鉴定，其他蛙类米尔伊丽莎白菌分离鉴定可参考实 施。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19489实验室生物安全通用要求 动物病原微生物菌（毒）种保藏管理办法（2022年1月7日农业农村部令2022年第1号修订） 3术语与定义 下列术语与定义适用于本文件。 3.1 双毁髓法Doublepithing 毁髓针刺入蛙枕骨大孔后，将针后端压平，水平向前进入蛙颅腔，左右摆动，捣毁双侧脑组织。将 针抽出至枕骨大孔处，水平向后进入脊椎管，前后滑动捣毁脊髓。 3.2 聚合酶链式反应Polymerasechainreaction,PCR 在体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，是由高温变性、低温退火和中温延伸反应组成1个周期， 循环进行，使目的DNA得以快速进行扩增。 3.3 基因测序Genesequencing 基因测序是对基因序列上的碱基排列进行解析的过程。 3.4 回归感染Recurrentinfection DB36/T1881—2023 2实验室中通过人工手段，将某些分离得到的病原体（如细菌、病毒等）重新注入动物体内，观察动 物发病情况。 4设备和材料 设备和材料见附录A。 5培养基和试剂配制 培养基和试剂配制见附录B。实验室用水规格和试验方法参照GB/T6682执行。 6分离与鉴定技术流程 图1黑斑侧褶蛙米尔伊丽莎白菌分离鉴定技术流程 DB36/T1881—2023 37操作步骤 7.1采样 7.1.1病蛙采集回实验室后，用清水清洗蛙体。 7.1.2对病蛙进行双毁髓法操作。 7.1.3待病蛙完全进入死亡状态后，用酒精棉球（75%酒精）对病蛙体表和眼部消毒。 7.1.4将杀菌消毒后的病蛙置于无菌操作台内的托盘上，用镊子和手术剪刀进行解剖，取出眼部、脑 部、肝、脾、肾组织。 7.2病菌的培养 7.2.1在无菌状态下将所采组织进行剪碎或匀浆。 7.2.2将剪碎或匀浆后的组织液与营养肉汤按照1:10比例进行混合，恒温培养箱（28℃±1℃） 振荡（180r/min）培养24h。 7.2.3将培养好的菌悬浊液摇晃均匀，在无菌状态下划线接种于营养琼脂中，恒温培养箱（28℃± 1℃）培养24h，观察。 7.2.4选取优势菌落接种于新的营养琼脂，恒温培养箱（28℃±1℃）培养24h，待进一步鉴定。 7.3病菌样品的鉴定 7.3.1形态学鉴定 菌落颜色为米色或淡黄色，边缘整齐，半透明，表面湿润、光滑。 7.3.2分子生物学鉴定 7.3.2.1PCR模板的制备 接种环挑选培养基上待检菌落，置于0.5mL灭菌生理盐水中，4000r/min离心2min，弃上清；再加 0.5mL无菌水重悬并涡旋混匀，100℃沸水中煮沸10min后，移至冰面上，冷却后4000r/min离心30s， 取上清液作为PCR模板待用。 7.3.2.2PCR反应体系的配制 按照10×PCRbuffer2μL，dNTPmix2μL，上下游引物各0.5μL（10μmol/L），Taq酶(2.5U/μL)0.2 μL，菌液2μL，ddH2O12.8μL配制20μLPCR反应体系。 7.3.2.3PCR反应条件 16SrDNA扩增条件：95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，共32个循 环，最后72℃延伸10min。 gyrB基因扩增条件：95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共32个循 环，最后72℃延伸10min。 7.3.2.4电泳及成像观察 取5µLPCR扩增产物和1µL上样缓冲液，混匀后加入1.2%琼脂糖凝胶电泳加样孔中，同时在空白 孔加入5µLMa