ICS 65.020.20 CCS B 05 34 安 徽 省 地 方 标 准 DB34/T 3716—2020 动物园饲养猫科动物巴贝斯虫病防治 技术规程 Technical regulation for prevention and control on felid babesiosis at zoo 2020-11-27 发布 2020-12-27 实施 安徽省市场监督管理局 发 布 DB34/T 3716—2020 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由安徽农业大学和合肥市野生动物园提出。 本文件由安徽省林业局归口。 本文件起草单位：安徽农业大学、安徽省合肥市野生动物园、安徽省芜湖市赭山动物园、安徽省繁 昌县动物疫病与预防控制中心、安徽省绩溪县畜牧水产局、安徽省动物疫病预防与控制中心。 本文件主要起草人：徐前明、王根红、查日华、胡嘉彦、易刚、方海、杨文超、李应列、鲁思光、 王艳、张志忠、王桂军、占松鹤、何长生。 I DB34/T 3716—2020 动物园饲养猫科动物巴贝斯虫病防治技术规程 1 范围 本文件规定了动物园猫科动物巴贝斯虫病的诊断、防治、监测相关技术要求。 本文件适用于动物园饲养野生猫科动物巴贝斯虫病的防治。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 NY/T 472绿色食品 兽药使用准则 《中华人民共和国动物防疫法》(2015年修正) 中华人民共和国主席令第二十四号 《中华人民共和国兽药典》2005年版 《中华人民共和国兽药规范》 《动物性食品中兽药最高残留限量》中华人民共和国农业部公告 第235号 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 传播媒介 vector 在脊椎动物宿主之间传播寄生虫病的一种低等动物，更常指的是传播血液原虫的吸血节肢动物。 3.2 巴贝斯虫病 Babesiosis 危害动物的一种血液原虫病，其致死率较高，发病明显，具有季节性，其主要通过蜱虫等媒介进行 传播的。 3.3 综合防治 comprehensive prevention and control 针对猫科动物药物防治以及所采取的其他各种措施的总称，包括外界环境除虫、预防家畜感染、提 高机体抵抗力等。 3.4 稽留热 continuous fever 此型的特点是：高热持续数日不退，其昼夜温差不超过1℃。 4 防治对象 4.1 猫科动物 包括虎类动物，豹和狮等。 4.2 传播媒介 1 DB34/T 3716—2020 本地区最为常见的主要硬蜱中的血蜱属蜱虫。 5 诊断方法 5.1 病史调查 对本文件所述巴贝斯虫病流行病学进行调查研究，包括流行因素、感染季节、强度、年龄、宿主易 感性分析。 5.2 临床症状观察 巴贝斯虫病：高热（稽留热）、贫血、黄染、血红蛋白尿，颌下和胸前等淋巴结肿大，消瘦。 5.3 病理变化 对死亡动物进行病理学观察：皮下组织胶样水肿，血液稀薄，凝固不全，脾肿大软化，胃、肠粘膜 炎症、出血、糜烂。 5.4 病原学检查 5.4.1 病原学检查 5.4.1.1 吉姆萨染色法检查：静脉采集全血，制作血涂片后，用甲醇固定，然后用经吉姆萨染料染色 30～60min，最后镜检。 5.4.1.2 判定标准：在红细胞内发现典型的虫体，大小约为 2～4μm，有杆状、梨籽形的，染色后明 显具有染色质团呈蓝色，核呈紫红色的。 5.4.2 分子生物学鉴定 对患病动物的血液提取基因组 DNA，然后扩增巴贝斯虫 18S Rrna 基因。套式 PCR 技术用于扩增 18S rRNA 基因引物以及反应条件见附录A。所扩增的 PCR 产物经 1％琼脂糖凝胶电泳分析，所扩增的 基因序列为 359 bp。 5.5 传播媒介蜱虫种类的鉴定 5.5.1 形态学鉴定 按《兽医寄生虫学》 方法对不同属的蜱进行简易鉴定，进一步鉴定需通过分子生物学方法加以鉴定。 5.5.2 PCR 技术扩增蜱虫 ITS-1 基因序列 依据蜱虫 ITS-1 基因（间隔转录基因）进行分子生物学鉴定，确定其种类。用于扩增 ITS-1 基因 引物设计和反应条件见附录B， PCR 产物经纯化后进行序列测定分析。 6 防治 6.1 防治原则 以本规范所述巴贝斯虫病的流行规律为依据，药物防治和综合防治方法相结合。杀虫、生血和提高 机体抗病力为基本防治原则。 6.2 治疗 2 DB34/T 3716—2020 对发病动物或隐性感染动物进行治疗。主要采用以咪唑苯脲治疗猫科动物巴贝斯虫病，同时配合使 用 VB12 生血，增加食欲药物如柴胡等辅助性治疗。 6.3 预防 6.3.1 药物防治 6.3.1.1 防治动物体表蜱虫 6.3.1.1.1 全年猫科动物实施至少进行 4 次给药，次数应根据猫科动物生长状态、流行病学等特征进 行酌量增减。 6.3.1.1.2 通过体内给药和体表药浴相结合，具体如下。 ——体内给药：应用伊维菌素、多拉菌素或阿维菌素等给药，皮下注射方式给药； ——体表给药：应选用溴氰菊酯类药物淋浴或喷洒，在夏秋季节时每隔 1 月进行 1 次，从四月初 开始，至十月下旬结束。 6.3.1.2 周围环境净化和消灭蜱虫 及时去除虎舍、狮舍、豹舍等周边杂草，压缩蜱虫的生存空间，对周边杂草中使用溴氰菊酯类药物 消灭蜱虫幼虫、若虫和成虫等。 6.3.2 动物园区内蜱虫活动情况监测 采用干冰诱捕方法或者布旗法对动物园区或邻近草丛蜱虫采集，评估蜱虫活动范围和种类，以便控 制做好环境灭蜱虫工作。 6.3.3 防治时间 使用阿维菌素拌料给药，及时清除体表蜱虫感染，每隔 2～3 月重复给药 1 次；溴氰菊酯类药物 药浴时应在夏秋季节时每隔 1.5 月进行 1 次，从四月初开始，至十月上旬结束，如进行淋浴时应间隔 15 d 重复 1 次。可适当调整防治时间。每年 4 月开始肌肉注射 1 次，7 月份重复 1 次。 6.3.4 防治密度 实行整群药浴和给药预防，不遗漏。 6.3.5 药物选择 依据《中华人民共和国兽药典》、《中华人民共和国兽药规范》、《中华人民共和国动物防疫法》、 《动物性食品中兽药最高残留限量》和 NY/T 472 的规定，使用兽药主管部门批准公布的抗寄生虫药物。 6.3.6 其他防治措施 6.3.6.1 圈舍灭虫处理：畜舍设施改善，地面和墙面应无缝隙、漏洞等，减少蜱虫等存在空间。圈舍 墙壁、地面、围栏、用具、饲喂工具等，应用兽用杀虫药物，定期喷洒灭蜱虫。 6.3.6.2 环境中蜱虫防治：动物园区内高密植被或丛林应与畜舍保持不少于 50m 的距离。湿地和森林 是重点防治区域，以利净化，加强动物园区深草丛的清除和砍伐，同时减少动物到深草丛或灌木林区活 动次数和频率。 7 监测 3 DB34/T 3716—2020 7.1 监测方法 7.1.1 新型抗寄生虫药物大范围推广应用以及常用抗巴贝斯虫药物在连续使用 5 年以上的，须进行临 床药效试验或验证，评价其驱虫和杀虫效力。 7.1.2 4～5 份月考核防治密度（次数），而 6～8 月份评价防治效果。 7.2 监测时间 以猫科动物发生该病的流行病学规律为依据，确定监测时间。 7.3 监测抽样 抽样时，样本数不得低于群体数的 35％。 7.4 监测指标及计算方法 7.4.1 平均感染率（infection rate）：猫科动物巴贝斯虫平均感染率（％）=阳性数／抽检总数×100％ 7.4.2 治愈率（cure rate）：治愈率=虫体转阴动物数／试验动物数×100％ 7.5 档案管理 做好防治记录，主要从防治动物数量、用药品种、使用剂量、环境与粪便无害化处理、补饲、发病 率、病死率及死亡原因、诊治情况等，建立发病及防治档案（具体情况见附录C）。 4 DB34/T 3716—2020 附 录 A （资料性） PCR 所扩增巴贝斯虫的 18Sr RNA 基因引物序列和反应条件 A.1 套式 PCR 扩增巴贝斯虫 18Sr RNA 基因的引物序列和反应条件 见表A.1。 表A.1 所设计的引物序列和套式 PCR 反应条件 引物名称 上游引物 （Bab-1-F） 下游引物 （Bab-1-R:） 上游引物 （Bab-2-F） 下游引物 （Bab-2-R:） 序列 5’-AATTACCCAATCCTGACACAGG-3’ 5’-TTTCGCAGTAGTTCGTCTTTAACA-3’ 5’-GACACAGGGAGGTAGTGACAAGA-3 5’-CCCAACTGCTCCTATTAACCATTAC-3’ 反应条件 95℃预变性5min； 95℃变性30s，57℃退火 30s，72℃延伸 40s，30个循环； 72℃延长 7min； 4℃保存 95℃预变性5min； 95℃变性30s，57℃退火 30s，72℃延伸 40s，30个循环； 72℃延长 7min； 4℃保存 A.2 套式 PCR 反应体系 A.2.1 第一次25μL PCR反应体系组成如下： ——ddH2O 15.85 μL； ——10×buffer 2.5 μL； ——25 mmol/L MgCl2 1.5 μL； ——2.5 mmol/L dNTP 2 μL； ——上、下游引物(20 pmol/μL)各 1 μL； ——基因组 DNA 1 μL； ——Ex Taq 酶(1 u/μL) 0.15 μL。 A.2.2 第二次25μL PCR反应体系组成如下： ——ddH2O 15.85 μL； ——10×buffer 2.5 μL； ——25 mmol/L MgCl2 1.5 μL； ——2.5 mmol/L dNTP 2 μL； ——上、下游引物(20 pmol/μL)各 1 μL； ——第一次 PCR 产物 DNA 1 μL； ——ExTaq 酶(1 u/μL) 0.15 μL。 5 DB34/T 3716—2020 附 录 B （资料性） PCR 扩增蜱虫 ITS-1 基因（间隔转录基因）引物序列和反应条件 B.1 PCR 扩增蜱虫 ITS-1 基因的引物序列和反应条件 见表B.1。 表B.1 所设计的引物序列和套式 PCR 反应条件 引物名称 上游引物 （ITS-F） 下游引物 （ITS--R:） 序列 5′-TCATAAGCTCGCGTTGATT-3′ 5′-AGCTGGCTGCGTTCTTCAT-3′ 反应条件 95℃预变性5 min； 94℃变性45 sec，50℃