ICS 65.020.01 CCS B05 4115 信 阳 市 地 方 标 准 DB 4115/T 078—2020 息半夏组织培养及育苗技术规程 2020 - 12 - 30 发布 2021 - 03 - 30 实施 信阳市市场监督管理局 发 布 DB 4115/T 078—2020 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由息县工业和信息化局提出。 本文件由息县工业和信息化局归口。 本文件起草单位：河南息半夏药业有限公司、信阳农林学院、河南省野生药材综合开发利用工程技 术研究中心、息县市场监督管理局。 本文件主要起草人：李金平、陈琼、刘振华、王金合、杨俊杰、李丹、赵斌、李晓斌。 I DB 4115/T 078—2020 息半夏组织培养及育苗技术规程 1 范围 本标准规定了息半夏组织培养的生产技术流程和炼苗移栽操作规范。 本标准适用于信阳市行政区域内息半夏组织培养及育苗。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 317 白砂糖 GB/T 603 化学试剂 试验方法中所用制剂及制品的制备 GB 5749 生活饮用水卫生标准 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 22278 良好实验室规范原则 HG/T 3491 化学试剂 活性炭 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 植物组织培养 指利用植物体的器官、组织细胞或原生质体作为外植体，采用无菌操作接种于人工配制的培养基上， 在一定的光照和温度条件下进行培养，使之生长、分化并发育成完整小植株的技术。 外植体 植物组织培养所用的材料。 培养基 由水、无机盐类、有机物质、蔗糖、植物生长调节剂及琼脂等组成的培养基质。 组培苗 利用优良息半夏品种的块茎、叶片、叶柄作为外植体，采用植物组织培养技术，培养再生出来的试 管苗。 褐化 褐化是由于组织中的多酚氧化酶在氧气的参与下，使酚类物质被氧化后产生褐色醌类物质。 1 DB 4115/T 078—2020 玻璃化 “试管苗玻璃化”是指在进行植物组织培养中，试管苗生长异常，叶、嫩梢呈透明或半透明的水浸 状，芽苗矮小肿胀失绿，叶片皱缩成纵向卷伸，脆弱易碎。这些试管苗在培养过程中发生了一种生理失 调或生理病变，表现出分化能力低，难以增殖成芽，也难以生根成苗。 增殖培养 把外植体初次培养(即初代培养)获得的培养物转移到新鲜的培养基中，如此反复多次进行培养，从 而使培养物得以成倍增殖的过程。 培养代数 同一外植体，经继代培养的次数。 4 息半夏组织培养技术流程 实验室要求 息半夏组织培养实验室包括：药品室、洗涤室、准备室、接种室、培养室、档案室，同时配备调温 设施。 实验室应符合GB 19489和GB/T 22278的要求。 培养基及其配制 4.2.1 母液的配制和保存 将常用药品配制成比所需浓度高50～100倍的母液，药品配制严格按照GB/T 603规定方法配制，所 用水执行分析实验室用水规格和试验方法标准（所用水应符合GB/T 6682三级水的要求）。 称量不同的药品使用不同的汤匙，避免药品的交叉污染与混杂。 息半夏组织培养以MS培养基为基本培养基，所用化学试剂应符合国家有关标准规定。 配制好的母液分别贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期。母液贮藏温度2℃～10℃，贮藏时间 ≦3个月，如有霉菌和沉淀产生，则不得使用。 4.2.2 不溶于水药品的溶解方法 2，4-D、NAA等不溶于水的药品先用少量95%乙醇溶解，然后加水定容。 6-BA先溶于少量0.1mol/L的盐酸中，再加水定容。 所用水应符合GB/T 6682三级水的要求。 4.2.3 4.2.3.1 培养基配制 基本培养基 由药品、蔗糖、琼脂、水组成，蔗糖和水，应分别符合GB 317和GB 5749规定。 所需蔗糖的浓度是20g/L，琼脂粉的浓度是5.5g/L。 成苗培养阶段，加入0.25% 符合HG/T 3491规定的活性炭，减少组织培养的褐化和玻璃化，同时有 利于息半夏壮苗。培养基的配制程序如下： 2 DB 4115/T 078—2020 4.2.3.2 诱导培养基配制 配方为MS+2,4-D（0.2mg/L）+6-BA（4mg/L），按照培养基配制程序配制。 4.2.3.3 成苗培养基配制 配方为1/2MS+2,4-D（1mg/L）+6-BA（0.5mg/L），按照培养基配制程序配制。 4.2.3.4 叶片培养基配制 配方为MS+6-BA（1mg/L）+NAA（0.1mg/L），按照培养基配制程序配制。 4.2.3.5 叶柄培养基配制 配方为MS+6-BA（1mg/L）+NAA（0.2mg/L），按照培养基配制程序配制。 4.2.4 pH 值 息半夏培养基最适宜pH值为5.5～6.5。 4.2.5 培养基的分装和灭菌 配制好的培养基趁热分装，分装量以占培养容器的1/4～1/3为宜。 切勿将培养基沾到瓶口和外壁上，以免杂菌污染。分装后立即加盖进行灭菌，121℃灭菌20min～30 min。 消毒 4.3.1 工作环境 保持组培室清洁卫生。接种室与培养室每隔 3个月密闭门窗用高锰酸钾—甲醛（3:5）熏蒸 10h～ 12h，然后打开门窗通风换气。 4.3.2 操作要求 超净工作台台面用75%乙醇等消毒液擦拭，并用紫外线照射20min。工作人员洗手、消毒，上工作台 后用75%乙醇擦拭双手和培养容器外表面。 整个接种工作在近火焰处进行。接种完成后迅速封口。 4.3.3 接种工具的消毒 接种工具采用热压灭菌或其他方式灭菌，接种时在超净工作台内取出。 使用的消毒液要每周更换。 4.3.4 外植体的消毒 3 DB 4115/T 078—2020 将清洗干净的息半夏块茎剥去表皮（小心保护好芽尖），用流动饮用水冲洗30min后，在超净工作 台上用75%乙醇浸泡10s～20s，以无菌水冲洗2次，再用0.1%升汞消毒8min～10 min，无菌水冲洗5～6次 后即可接种。 培养材料及接种 4.4.1 培养材料的选择 外植体选择无病虫伤害的野生健壮息半夏块茎，个头中等，表面光滑、皱褶少。 4.4.2 材料的接种 将消毒好的直径约1cm～4cm息半夏中等块茎接种到MS培养基上，芽尖朝上摆放固定。接种后做好标 记，写明材料名称、接种日期。 试管苗初代培养 4.5.1 保证外植体和培养基的无菌状态及培养室良好清洁环境条件。 4.5.2 息半夏最适宜的培养温度 25℃±2℃，光照强度为 1500Lx～2000Lx，光照时间为 10h/d～12h/d。 4.5.3 当接种的息半夏块茎芽尖长到 1cm 时，切下芽尖，接种到诱导培养基培养。芽尖可以反复切取， 直至不能长出新芽尖或已经污染。在这个过程中防止交叉污染的发生，用过的工具及时消毒后再继续使 用。 4.5.4 接种好的培养瓶放置在条件适宜的培养架上，培养 50d 左右，形成大量的丛生芽和愈伤组织。 4.5.5 丛生芽和愈伤组织转接到成苗培养基上，培养 25d～30d，形成完整的试管苗。 4.5.6 试管苗的增殖培养 4 DB 4115/T 078—2020 4.5.7 叶片培养 将试管苗浓绿厚大的叶片切成0.5cm×0.5cm的切片，叶面朝上接种于叶片培养基， 培养周期50d～ 60d。 4.5.8 叶柄培养 将试管苗生长健壮的叶柄切成0.5cm～1cm长的段，接种于叶柄培养基，培养周期45d～55d。 4.5.9 小块茎培养 将剪掉叶片和叶柄的无菌小块茎转接到成苗培养基上，培养周期25d～30d。 4.5.10 从生芽和愈伤组织培养 将叶片与叶柄培养形成的丛生芽和愈伤组织转接至成苗培养基上，培养周期25d～30d。 5 炼苗移栽操作规范 5 DB 4115/T 078—2020 光培炼苗 选择生长健壮的试管苗，打开瓶盖，在自然光、室温下炼苗3d～5d后移栽。 驯化移栽 从培养瓶中取出经过锻炼的组培苗，饮用水洗去附着的培养基，移栽于蛭石中。移栽后用遮阳率为 75%的遮阳网遮阳，在温度25℃左右，相对湿度85%条件下生长5d～7d。 苗期管理 5.3.1 肥水管理 根据天气情况及时浇水，保持基质内含水量50%～60%（将蛭石用手捏，蛭石能成块但不出水为宜）。 每隔7d，用与MS培养基浓度相当的微量元素配制营养液，稀释10倍进行喷施，保证苗床的肥力。 使用温控设施，动态监控温度变化，整个生长期间保持温度25℃左右，遮阳率75%左右，使组培苗 健康生长。 5.3.2 病虫草害管理 5.3.2.1 主要病害及防治 5.3.2.1.1 叶斑病 用 1∶1∶100的波尔多液和40%多菌灵可湿性粉剂300倍液交替喷防3～5次。 5.3.2.1.2 根腐病 及时拔除病株烧毁，并用10%的石灰水对病穴消毒，发病初期用50%多菌灵或70%甲基托布津可湿性 粉剂1000倍液淋穴或浇灌病株根部。 5.3.2.1.3 叶柄腐烂病(猝倒病) 发现病株及时拔除，用95%恶霉灵可湿性粉剂4000～5000倍液，或50%多菌灵可湿性粉剂800倍液喷 雾，7d～10d喷1次，连喷3次以上。 5.3.2.2 主要虫害及防治 5.3.2.2.1 虫害种类 红天蛾幼虫和菜青虫幼虫。 5.3.2.2.2 防治方法 天敌防治：利用小花椿、中华跃蛛、赤眼蜂等天敌来防治。 生物防治：喷洒苏芸金杆菌800～1000倍液；或将白僵菌配成含量为不少于1亿孢子/ ml的菌液进行 喷洒；或亩用20幼虫单位菜粉蝶颗粒体病毒；或选用叶面肥20%灭幼脲悬浮剂800倍液喷洒。 5.3.2.3 草害防治 整个生育期及时除草，严防草荒。 种茎收获与贮藏 5.4.1 6 时间 DB 4115/T 078—2020 组培苗生长100d～120d后，85%的种茎直径超过0.8cm时，即可收获。 5.4.2 方法 收获前7d停止浇水或营养液。 收获时按行开沟，捡拾种茎和珠芽，再用细筛将蛭石筛1遍，筛选漏收的种茎。 5.4.3 贮藏 将小种茎用湿沙掩埋后在4℃以下低温贮存，也可将小种茎窖藏或埋入地下湿土中，以保持水分。 7