ICS 67.040 B 30 江 DB36 西 省 地 方 标 准 DB36/T 1373—2020 马铃薯晚疫病菌生理小种鉴定技术规程 Technical rules for identification on the physiological races of Phytophthora infestans on potato 2020 - 12 - 29 发布 江西省市场监督管理局 2021 - 07 - 01 实施 发 布 DB36/T 1373—2020 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 接种体制备 ........................................................................ 2 5 鉴别寄主的培育 .................................................................... 3 6 接种鉴定 .......................................................................... 3 7 病情调查 .......................................................................... 4 8 灭活处理 .......................................................................... 4 附录 A（资料性） 致病疫霉菌形态特征 .................................................. 5 附录 B（资料性） 马铃薯晚疫病菌生理小种的命名方法 .................................... 6 I DB36/T 1373—2020 前 言 本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由江西省农业农村厅提出并归口。 本文件起草单位：江西省农业科学院植物保护研究所。 本文件主要起草人：何烈干、邹芬、马辉刚、涂玉琴、王美清、赖金美、朱业斌、朱跃冬、王修慧。 II DB36/T 1373—2020 马铃薯晚疫病菌生理小种鉴定技术规程 1 范围 本文件规定了马铃薯晚疫病菌的采集分离纯化、生理小种室内鉴定培养基的制备、鉴别寄主的培育、 接种鉴定、病情调查、生理小种的鉴定、供试材料的高温灭活处理。 本文件适用于马铃薯晚疫病菌的生理小种鉴定。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 马铃薯晚疫病 potato late blight 由疫霉属致病疫霉Phytophthora infestans (Mont.)de Bary侵染马铃薯所引起的一种毁灭性病害。 能侵染马铃薯的叶片形成坏死，也能侵染茎和块茎，并能在腐烂的植株上继续侵染。 3.2 接种体 inoculum 用于人工接种鉴定所需的马铃薯晚疫病菌Phytophthora infestans的孢子囊悬浮液。 3.3 鉴别寄主 differential host 一套含有主效抗性基因R1～R11和已知无R基因的感病材料（resistance）的马铃薯品种。 3.4 生理小种 physiological race 病原物种内或专化型内在形态上无差异，但在寄主植物的品种上具有致病性差异的类群。 3.5 人工接种 artificial inoculation 在适宜的条件下，通过人工操作将一定浓度马铃薯晚疫病菌的孢子囊悬浮液接种到马铃薯植株的适 当部位使之发病的过程。 1 DB36/T 1373—2020 3.6 离体叶片接种法 detached leaflets inoculation 使接种体与离体叶片接触以促使组织发病的一种鉴定方法。 4 接种体制备 4.1 病样的采集 在晚疫病发生较为严重的田块，选择具有典型症状的病叶随机采取5片，记录采集时间和地点，放 入冰壶内1天内带回实验室进行分离，分离物经形态学鉴定（附录A）为致病疫霉后，再进行分离物纯化 和生理小种鉴定。 4.2 培养基和试剂 4.2.1 白云豆培养基 称取白云豆粉60 g，用55 ℃水浴1 h，双层纱布过滤后加入V8蔬菜汁100 mL，琼脂粉20 g，CaCO31.4 g，加入蒸馏水定容至1000 mL后在121 ℃下高压蒸汽灭菌20 min。 4.2.2 选择性培养基 -1 -1 -1 在上述培养基中加入利福平20 mg·L ，氨苄青霉素200 mg·L ，70%五氯硝基苯100 mg·L 。 4.2.3 MS 培养基 硝酸钾1900 mg，硝酸铵1650 mg，磷酸二氢钾170 mg，硫酸镁370 mg，氯化钙440 mg，碘化钾0.83 mg，硼酸6.2 mg，硫酸镁22.3 mg，硫酸锌8.6 mg，钼酸钠0.25 mg，硫酸铜0.025 mg，氯化钴0.025 mg， 乙二胺四乙酸二钠37.25 mg，硫酸亚铁27.85 mg，肌醇100 mg，甘氨酸2 mg，盐酸硫胺素0.1 mg，盐酸 吡哆醇0.5 mg，烟酸0.5 mg，蔗糖30000 mg，琼脂7000 mg，蒸馏水1000 mL，pH调至5.8。 4.2.4 试剂 75%酒精、0.5%～0.8%水琼脂、5%～20%NaClO溶液、利福平、氨苄青霉素、70%五氯硝基苯。 4.3 病原物的分离与纯化 4.3.1 叶片保湿分离纯化法 将具有典型症状的叶片在自来水下冲洗干净，然后用蒸馏水冲洗1遍，用滤纸吸取叶片表层的水分。 用灭菌过的剪刀在病健交界处剪取3 mm×3 mm叶块，背面朝上置于0.5%～0.8%水琼脂培养基上保湿培养 24 h，然后用灭菌挑针挑取小块菌丝块，接种在选择性培养基上，把培养基放在18 ℃的生化培养箱中 黑暗培养3 d后，从菌落边缘挑取菌丝置于选择性培养基上，并放入18 ℃的生化培养箱中黑暗培养纯化， 备用。 4.3.2 块茎夹叶分离纯化法 将健康的马铃薯块茎经表面消毒（将马铃薯表面浸入75%的乙醇溶液后取出，用5%NaClO 溶 液 表 面 消毒5 min,用无菌水冲洗3遍）后，用消毒刀切成厚0.5 cm左右的薄片，置于灭菌培养皿中，然后在病 叶的病健交界处剪取约5 mm×5 mm的叶片组织，置于已消毒的两薯片之间，在18 ℃黑暗条件下培养，3 2 DB36/T 1373—2020 d后在薯片上即可见白色霉层，用灭菌挑针在薯片上挑取晚疫病菌菌丝，放在选择性白云豆培养基上， 每皿接种3点，将培养皿置于生化培养箱中18 ℃黑暗培养7 d后，在菌落边缘挑取少量菌丝转移到选择 性白云豆培养基上，在18 ℃黑暗条件下培养7d，纯化备用。 4.4 孢子悬浮液的制备 菌株在培养基上纯化培养7 d后，将其转移至经表面消毒的新鲜薯片上，按4.3.2方法培养使其产生 孢子囊，5 d后薯片表面即可见大量白色霉层，用玻片刮下菌体放入装有3 mL灭菌水的离心管中，充分 振荡配成孢子囊悬浮液，用双层纱布过滤，血球计数器计数，将浓度调制成每毫升含2500个孢子囊，将 悬浮液置于4 ℃冰箱中2 h诱导游动孢子的释放，备用。 5 鉴别寄主的培育 统一鉴别寄主（含R1～R11）均为无菌保存的试管苗，用MS培养基扩繁寄主，待试管苗移植15 d后， 转接到1/2MS培养基上扩繁，20 d左右将寄主试管苗扦插于以珍珠岩为基质的塑料盆中，第一周用清水 浇灌，之后用营养液浇灌，控制温度25 ℃自然光照条件培养，约30 d后取植株中部相同叶龄的健康复 叶进行接种鉴定。 6 接种鉴定 6.1 鉴定方法 采用离体叶片接种法。将采集到的健康复叶背面朝上，置于1%水琼脂培养基上，用微量移液器吸取 20 uL配置的游动孢子悬浮液，接种到叶片中部叶脉的两侧，每个菌株接种10片同一鉴别寄主小叶，重 复3次，以无菌水处理为空白对照。 6.2 接种管理 接种后将叶片置于18 ℃黑暗条件下12 h，然后在20℃、12 h光周期的培养箱中培养观察菌丝体以 及孢子囊是否形成。 7 病情调查 7.1 调查时间 接种后第4 d观察记录感病情况，第7d～10d观察是否形成菌丝体和孢子囊。 7.2 调查方法 在鉴别寄主接种部位产生菌丝体和孢子囊，即确定为侵染，则记录为感病（S），在接种部位无症 状或出现免疫症状，即确定为不侵染，则记录为抗病（R）。若各处理的重复叶片有4/5及以上为感病型， 则该菌株对寄主有毒力。如果同一处理的3个重复的结果不一致则视为无效处理。 根据供试菌株在统一鉴别寄主上的抗感类型来确定其生理小种类型。各生理小种的命名方法见附录 B。 8 灭活处理 3 DB36/T 1373—2020 试验结束后需将所有材料及器具置于高压灭菌锅中121 ℃、20 min处理以使病原菌失去活性。 4 DB36/T 1373—2020 AA 附 录 A （资料性） 致病疫霉菌形态特征 致病疫霉菌菌落为白色棉絮状，菌丝无色无隔，粗 4.9μm～12.0μm，壁薄，自由分枝，孢囊梗由 菌丝生出，粗 5.0μm～9.0 μm，直立，无色，合轴分枝，顶端稍膨大并着生孢子囊，孢子囊单胞无色， 卵圆形，具半乳突，顶生，大小为（24.0～54.0）μm ×（19.0～30.0）μm，平均 35.6 μm×22.6 μm， 长宽比值为 1.5，基部逐渐变细，脱落，柄短，柄长 1.5μm～3.0 μm，萌发产生游动孢子或芽管，每 一孢子囊可释出 5～12 个游动孢子,见图 A.1。 图 A.1 致病疫霉菌形态特征（从左往右依次为菌落、孢子囊和游动孢子） 5 DB36/T 1373