(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210233579.0 (22)申请日 2022.03.10 (71)申请人 中国科学院南海 海洋研究所 地址 511458 广东省广州市南沙区海 滨路 1119号 (72)发明人 陈廷　李广丽　孙彩云　任春华　 江晓　田昌绪　蒋谋炎　王学锋　 陈小丽　刁德华　胡超群　 (74)专利代理 机构 广州科粤专利商标代理有限 公司 44001 专利代理师 朱聪聪　刘明星 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种豹纹鳃 棘鲈的SSR标记及其扩增引物和 应用 (57)摘要 本发明公开了一种豹纹鳃棘鲈的SSR标记及 其扩增引物和应用， 属于分子生物学技术领域。 本发明提供了如SEQIDNO.1～10所示的SSR标记 及其扩增引物， 所述SSR标记多态性强、 杂合度 高， 对采集于不同来源的16个个体进行遗传 多样 性分析即获得 14～18个等位基因， 在对遗传多样 性较低的群体(如增殖放流群体)进行评估时具 有优势； 引物扩增稳定、 重复性好， 因此本发明的 SSR标记及其扩增引物 应可用于豹纹鳃棘鲈遗传 多样性分析、 种群鉴定和增殖放流效果评估方 面。 权利要求书2页 说明书7页 序列表3页 附图1页 CN 114717326 A 2022.07.08 CN 114717326 A 1.一种豹纹鳃棘鲈的SSR标记， 其特征在于， 所述的SSR标记包括以下的一组或多组： PLDSSR‑01、 PLDSSR ‑02、 PLDSSR ‑03、 PLDSSR ‑04、 PLDSSR ‑05、 PLDSSR ‑06、 PLDSSR ‑07、 PLDSSR ‑ 08、 PLDSSR‑09、 PLDSSR‑10； 所述的PLD SSR‑01的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示； 所述的PLD SSR‑02的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示； 所述的PLD SSR‑03的核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示； 所述的PLD SSR‑04的核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示； 所述的PLD SSR‑05的核苷酸序列如SEQ  ID NO.5所示； 所述的PLD SSR‑06的核苷酸序列如SEQ  ID NO.6所示； 所述的PLD SSR‑07的核苷酸序列如SEQ  ID NO.7所示； 所述的PLD SSR‑08的核苷酸序列如SEQ  ID NO.8所示； 所述的PLD SSR‑09的核苷酸序列如SEQ  ID NO.9所示； 所述的PLD SSR‑10的核苷酸序列如SEQ  ID NO.10所示。 2.一种鉴定权利要求1所述的SSR标记的扩增引物， 其特征在于， 所述的扩增引物包括 以下的一组或多组： 针对PLDSSR‑01位点： PLDSSR‑01‑F： 5'‑TTCAGCTTCGGAGGGTGAAC‑3'； PLDSSR‑01‑R： 5'‑TGTTCAGTGTACTGC CCTGG‑3'； 针对PLDSSR‑02位点： PLDSSR‑02‑F： 5'‑TCACCTCAGCACT TAGGGGA‑3'； PLDSSR‑02‑R： 5'‑ATGACTGCTGCTCGCTCAT T‑3'； 针对PLDSSR‑03位点： PLDSSR‑03‑F： 5'‑GCCCAGTGCTA AAGACAGTCA ‑3'； PLDSSR‑03‑R： 5'‑CAGTGTGCAGTGCAGCT TTT‑3'； 针对PLDSSR‑04位点： PLDSSR‑04‑F： 5'‑TCCAGGTTCATCCTCAGGGT‑3'； PLDSSR‑04‑R： 5'‑TTGAAGCTGCTGA AGGTCGT‑3'； 针对PLDSSR‑05位点： PLDSSR‑05‑F： 5'‑CCAACTGCTTCAGGGGACAT‑3'； PLDSSR‑05‑R： 5'‑TGCCGGTCAGGTTTCTCTTC‑3'； 针对PLDSSR‑06位点： PLDSSR‑06‑F： 5'‑GCGCTCTG GGGTCAGTTATT‑3'； PLDSSR‑06‑R： 5'‑GGCTCCTGGTAACACAACGA‑3'； 针对PLDSSR‑07位点： PLDSSR‑07‑F： 5'‑CCACAGCCAGAAACCATGGA‑3'； PLDSSR‑07‑R： 5'‑AGGTACTGCTGCTCTAG GCT‑3'； 针对PLDSSR‑08位点： PLDSSR‑08‑F： 5'‑TGACGGTCATGTCT TTGAGGG‑3'； PLDSSR‑08‑R： 5'‑CAACAGTACCTCCCAGCGAG‑3'；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114717326 A 2针对PLDSSR‑09位点： PLDSSR‑09‑F： 5'‑CAGTTGCGCTAACAGGCTTG‑3'； PLDSSR‑09‑R： 5'‑AAACACATGCTAC CAGGGCA‑3'； 针对PLDSSR‑10位点： PLDSSR‑10‑F： 5'‑AGCTTTGTTGCAGCCTCTGA‑3'； PLDSSR‑10‑R： 5'‑CAGCAGCATGA ACAGGCAAG‑3'。 3.根据权利要求2所述的扩增引物， 其特征在于， 所述的扩增引物的正向引物的5'端标 记有荧光基团。 4.根据权利要求3所述的扩增引物， 其特征在于， 其特征在于， 所述的荧光基团为ROX、 FAM、 HEX或TAMRA。 5.一种豹纹鳃棘鲈SSR标记的检测试剂盒， 其特征在于， 包含权利 要求2、 3或4所述的扩 增引物。 6.一种高效评估豹纹鳃棘鲈种群遗传多样性的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)收集豹纹鳃棘鲈群 体样本， 提取豹纹鳃棘鲈个 体DNA； (2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板， 利用权利要求2、 3或4所述的扩增引物进行PCR 扩增； (3)对步骤(2)扩增的PCR产物进行分型； (4)对步骤(3)获得的分型 结果进行遗传多样性分析。 7.根据权利 要求6所述的方法， 其特征在于， 步骤(2)所述的PCR扩增， 其反应体系25 μL， 包括： 不含Mg2+的10×PCRbuffer  2.5 μL、 25mM MgCl22.0 μL、 10mM  dNTP 0.5 μL、 高保真PCR酶 1U、 10 μM正向引物0.5 μL、 10 μM反向引物0.5 μL、 DNA模板12.5ng， 其余由无菌双蒸水补足至25 μL； 其反应程序为： 95℃预变性5分钟； 95℃变性30秒， 60℃退火30秒， 72℃延伸30秒， 共35 个循环； 72℃再延伸6分钟。 8.根据权利 要求6所述的方法， 其特征在于， 步骤(3)所述的分型， 所述引物的5'端标记 FAM荧光基团， 利用基因型分型测序仪进行毛细管电泳分型。 9.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 步骤(4)所述的遗传多样性分析， 包括以下 的一项或多项： 每个位点的等位基因数(Na)、 有效等位基因数(Ne)、 香农信息指数(I)、 观测 杂合度(Ho)、 期望杂合度(He)、 固定指数(F)。 10.权利要求1所述的SSR标记、 权利 要求2、 3或4所述的扩增引物或权利要求5所述的检 测试剂盒在豹纹鳃棘鲈遗传多样性分析、 种群鉴定或增殖放 流效果评估方面的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114717326 A 3