ICS 65.020.01 CCS B05 廊 1310 坊 市 地 方 标 准 DB 1310/T 251—2021 软枣猕猴桃组织培养育苗技术规程 2021 - 11 - 15 发布 2021 - 12 - 15 实施 廊坊市市场监督管理局  发 布 DB 1310/T 251—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由廊坊市农业农村局提出。 本文件起草单位：廊坊市兴延科技服务有限公司、廊坊师范学院。 本文件主要起草人：苏彦苹、申彦平、冯雪、王秋芬、褚卓栋、孙艳香、张程亮、梁金明、袁志刚、 张方悦。 I DB 1310/T 251—2021 软枣猕猴桃组织培养育苗技术规程 1 范围 本文件规定了软枣猕猴桃组培育苗的术语和定义、培养基制备、初代培养、继代培养、炼苗、移栽、 大田移栽及管理、苗木出圃标准、保管、包装及运输、技术档案管理。 本文件适用于廊坊及气候相近地区软枣猕猴桃组织培养育苗生产。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6001—1985 育苗技术规程 GB 19174—2010 猕猴桃苗木 LY/T 1882—2010 林木组织培养育苗技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 组培苗 根据植物细胞全能性，将植物的体细胞、组织或器官进行离体培养，经过不同的细胞分化途径重建 形成不同的器官，诱导培育出的完整植株。 外植体 是指用于植物组织培养的接种材料，它包括植物体的各种器官、组织、细胞和原生质体等。 继代培养 将诱导产生的芽、愈伤组织、原球茎或胚状体等培养物重新分割，接种到新鲜培养基上进一步扩大 培养的过程。 4 培养基制备 培养基配方 基本培养基采用MS培养基，具体的外植体诱导培养基及继代培养基配方表见附录A。 母液配制 1 DB 1310/T 251—2021 按照LY/T 1882—2010林木组织培养育苗技术规程中第4章的4.1培养基母液配制及保存执行。 培养基配制 根据培养基配方与培养基配制量，按比例吸取母液配制培养基溶液，每加一种母液搅拌均匀后再加 入第二种母液，并加入0.7%的凝固剂与3%的蔗糖，加水定容后充分搅拌溶解。将配制好的培养基溶液装 入不锈钢锅，加热至沸腾，使培养基完全溶解，然后用1.0 mol/L盐酸或1.0 mol/L氢氧化钠溶液调整pH 值至5.8～6.0。培养基加热溶解后分装到高度为10 cm～15 cm的培养瓶内，体积为培养瓶容量的30%～40%， 密封后备用。 培养基灭菌 培养基配制完成后，在24 h内完成灭菌。将分装好的培养基放入灭菌锅内，严格按灭菌锅的使用要 求操作，灭菌气压0.11 MPa，温度121℃，灭菌时间20 min～25 min。培养基灭菌完成后待温度下降到80℃ 以下取出，放置在实验台上保存。 培养基保存 培养基宜现配现用。确需保存时，应放置在干净、避光的室内进行保存。室温25℃以下保存应在7 d 内使用完，2℃～4℃冷藏保存应在14 d内使用完。 5 初代培养 外植体采集 5.1.1 采集母株要求 采集母株为种质优良、性状稳定、生长健壮、无病虫害的软枣猕猴桃植株。 5.1.2 采集时间和方法 4月至9月，选择连续2 d以上晴天的傍晚，采集母株树冠外围中上部幼嫩新梢，剪除叶片作为外植 体备用；12月至翌年3月，采集一年生枝条，修剪成20 cm左右枝段，流水冲洗后将其下端浸泡在盛有清 水的容器中，在23℃～25℃培养箱中催芽，每2 d～3 d换一次水，待叶芽萌动长出新梢后，采集幼嫩新 梢做外植体。 5.1.3 采集记录 采集后标明品种名称、采集地点、采集时间、采集人等信息，建立信息档案。 外植体处理 5.2.1 保藏 可用湿润毛巾等保湿材料包裹后保存0.5 h～4.0 h；用泡沫保鲜箱配备冰袋低温保藏48.0 h，注意 枝条不可直接接触冰袋。 5.2.2 预处理 2 DB 1310/T 251—2021 用自来水冲洗外植体表面，将外植体剪成4.0 cm～6.0 cm的带芽茎段，放入装有0.3%～0.5%中性洗 洁剂水溶液的培养瓶中，于振荡培养箱中100转/分钟慢速振荡30 min，再用流水冲洗茎段1.0 h～2.0 h。 外植体消毒及接种 5.3.1 接种器具准备 5.3.1.1 超净工作台消毒 接种前使用75%酒精将超净工作台的台面及内壁擦拭干净，然后启动超净工作台并开启紫外灯消毒 30 min。关闭紫外灯后开启超净工作台风机，鼓风10 min后方可进行接种工作。 5.3.1.2 接种工具灭菌 接种剪、枪状镊、接种盘、烧杯等接种工具可提前用高压灭菌锅灭菌，在接种过程中可用置于超净 工作台上的酒精灯或电热消毒器灭菌。灭菌后的接种工具搁置在无菌的接种器皿上，待冷却至室温后方 可使用。 5.3.2 外植体消毒 用75%酒精对双手及手腕消毒，将预处理后的材料置于已消毒的超净工作台上，剪成带1个或2个芽 的茎段置于已灭菌的烧杯中，先用75%酒精浸泡外植体30 s，无菌水清洗3次，每次30 s，再用10%次氯酸 钠溶液灭菌10 min，无菌水清洗3次，每次30 s，用无菌滤纸吸干外植体表面的水分。也可选用其它外植 体消毒化学药品，按LY/T 1882—2010的有关规定执行。 5.3.3 接种 于超净工作台上将已消毒的外植体茎段两端各剪掉1 mm，垂直插入诱导培养基，每个培养瓶接种3 个茎段，均匀分布，接种后将培养瓶瓶口在酒精灯火焰上灼烧1 s～2 s，迅速盖好瓶盖，在培养瓶瓶壁 上标明品种名称、接种日期、接种人等信息，放入培养室培养。培养室温度控制在（25±1）℃，光照 强度为1500 lx～3000 lx，光照时数为16 h/d。 6 继代培养 在诱导培养基中培养20 d～30 d出芽后，用已灭菌的接种剪，将芽高1.0 cm以上的不定芽剪下，切 割成带1个芽的茎段，转接至继代培养基中。生长20 d～30 d后，将继代培养基中获得的不定芽，再次转 接至新配制的继代培养基中。此后定期将继代培养基中的不定芽分割、转接，扩大不定芽数量。 7 炼苗 当不定芽高度达3 cm以上时，先将培养瓶置于温度在20℃～30℃的温室进行闭瓶炼苗3 d，再打开培 养瓶盖炼苗2 d，炼苗期间避免强光直射和高温灼伤瓶苗。 8 移栽 容器 3 DB 1310/T 251—2021 容器规格为直径5.0 cm～6.0 cm、高度10.0 cm～12.0 cm的塑料营养钵或无纺布育苗袋。 基质 将蛭石和泥炭土按1:1体积比混合均匀，装入容器备用。 基质消毒 移栽前1 d～2 d用500倍～800倍的50%多菌灵溶液浇透。 温室移栽及管理 8.4.1 温室移栽 移栽时间在3月～4月进行。用自来水清洗干净不定芽基部的培养基，剪去部分老叶及基部的愈伤组 织，只留两叶一心，将不定芽基部用1 mg/mL的萘乙酸溶液速蘸5 s～10 s，快速移栽到营养钵或育苗袋 中，并浇透水。移栽时注意轻拿轻放以免损伤不定芽，移栽后7 d内用塑料薄膜或保鲜膜覆盖以保湿。 8.4.2 温湿度控制 移栽后保持温室温度在23℃～28℃，空气湿度85%以上。 8.4.3 水肥管理 移栽7 d～14 d后去除薄膜，浇水以见干见湿为原则，保证基质不缺水即可。移栽苗长出新叶后，每 隔7 d～10 d喷施1次叶面肥，连续喷3次～4次。 8.4.4 病虫害防治 病虫害防治遵照 GB/T 6001—1985的要求执行。 9 大田移栽及管理 温室幼苗高10 cm以上时，浇一次透水，选择在风小、光照弱的天气的傍晚，去除营养钵或育苗袋， 将带土坨的幼苗按株距20 cm、行距40 cm移栽到大田。移栽后浇一次透水，以后根据土壤水分状况及时 灌水。前期可追施氮肥，中后期适当增加磷钾肥的使用，并做好病虫害防治及人工除草和松土。 10 苗木出圃标准 侧根数量≥4条，侧根长度≥20 cm，当年生苗主干高度≥100 cm、地径≥0.4 cm、主干完全木质化。 11 保管、包装及运输 按照GB 19174—2010中第7章执行。 12 技术档案管理 按照 GB/T 6001—1985中第13章执行。 4 DB 1310/T 251—2021 附 录 A （资料性） 软枣猕猴桃组培苗培养基配方表 A.1 软枣猕猴桃组培苗培养基配方表见表 A.1。 表 A.1 软枣猕猴桃组培苗培养基配方表 成分名称 大量元素 铁盐 微量元素 有机物 碳源 植物生长调节剂 凝固剂 pH 药品名称 诱导培养基mg/L 继代培养基mg/L NH4NO3 825 1650 KNO3 950 1900 MgSO47H2O 185 370 KH2PO4 85 170 CaCl22H2O 165 330 FeSO47H2O 27.8 27.8 Na2EDTA 37.2 37.2 MnSO44H2O 22.3 22.3 H3BO3 6.2 6.2 ZnSO47H2O 8.65 8.65 KI 0.83 0.83 CuSO45H2O 0.025 0.025 Na2MoO42H2O 0.25 0.25 CoCl26H2O 0.025 0.025 甘氨酸 2 2 盐酸硫胺素 0.1 0.1 盐酸吡哆醇 0.5 0.5 烟酸 0.5 0.5 肌醇 100 100 蔗糖 30000 30000 6-BA 0.5 0.5 ZT 0.5 - 琼脂 7000 7000 6.0 6.0 注：FeSO47H2O应先与Na2-EDTA配合成络合物，然后才与其他溶液混合。 5