ICS 65.020.20 B 05 DB45 广 西 壮 族 自 治 区 地 方 标 准 DB 45/T 2171—2020 甘蔗品种真实性鉴定 SSR 分子标记法 SSR-based methods for variety genuineness testing of sugarcane 2020 - 10 - 29 发布 广西壮族自治区市场监督管理局 2020 - 11 - 30 实施 发 布 DB45/T 2171—2020 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由广西壮族自治区分析测试研究中心提出并宣贯。 本文件由广西糖业标准化技术委员会归口。 本文件起草单位：广西益谱检测技术有限公司、广西博测检测技术服务有限公司、广西吉锐安全技 术有限公司、广西壮族自治区分析测试研究中心。 本文件主要起草人：梁俊、刘守廷、黄易勤、苏丽梅、杜寒春、黄小娟、刘巧频、何慧、梁群清、 莫璋红、韦秋翠、韦秀兰。 I DB45/T 2171—2020 甘蔗品种真实性鉴定 SSR 分子标记法 1 范围 本文件规定了利用简单重复序列（SSR）标记进行甘蔗品种真实性鉴定的操作程序、数据记录与统 计、判定方法。 本文件适用于甘蔗品种SSR指纹数据采集及品种真实性鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 3 术语和定义 3.1 下列术语和定义适用于本文件。 推荐引物 recommended primer 品种鉴定中优先选用一套简单重复序列（SSR）引物，其检测位点具有多态性高、重复性好等综合 特性。 3.2 对照品种 control variety 对照品种具有所用SSR位点上不同等位变异的特性。对照品种用于辅助确定待测样品的等位变异， 校正仪器设备的系统误差。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 SSR：简单重复序列（Simple sequence repeats）； PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）； DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid）。 5 原理 依据甘蔗品种基因组中SSR的重复次数存在差异，通过PCR扩增及电泳技术可以鉴定甘蔗品种。 1 — DB45/T 2171 2020 6 材料和试剂 除另有说明外，本文件中使用分析纯（含）以上试剂，用水符合GB/T 6682规定的二级水，其中PCR 用水要求达到一级水指标。 6.1 试剂 三羟甲基氨基甲烷（C H NO ）：纯度＞99%。 乙二胺四乙酸二钠(EDTA·2Na)：纯度≥99.0%。 硼酸（H BO ）：ρ=1.43 g/cm³，含量≥99.5%。 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）：ρ=1.32 g/mL，纯度≥99.0%。 氯化钠（NaCl）：ρ=2.165 g/cm³，含量≥99.5%。 琼脂糖。 过硫酸铵（(NH ) S O ）：ρ= 1.98 g/cm³，含量≥98.0%。 氢氧化钠(NaOH）：ρ= 2.13 g/cm³，含量≥96.0%。 硝酸银（AgNO ）：ρ= 4.35 g/cm³，含量≥98.0%。 甲醛（HCHO）：ρ=0.815 g/cm³。 液氮（N ）：ρ=0.81 g/cm³。 三氯甲烷（CHCl ）：ρ=1.50 g/cm³。 无水乙醇（CH CH OH）：ρ=0.79 g/cm³，含量≥99.7%。 DNA 分析仪用 LIZ 500 分子量内标。 去离子甲酰胺（CH NO）：ρ=1.133 g/mL。 40%丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液（Acryl/Bis Solution(29:1)）。 四甲基乙二胺（TEMED）：ρ= 1.32 g/mL。 DNA 分子量标准（DNA marker）：可以清楚区分 50 bp～500 bp 的 DNA 片段。 2×Taq Plus PCR 预混试剂：0.1 U/μL Taq Plus Polymerase、500μM dNTP each、20 mM Tris-HCl(pH=8.3)、100 mM KCl、3 mM MgCl 、稳定剂、增强剂。 6.1.1 6.1.2 6.1.3 6.1.4 6.1.5 6.1.6 6.1.7 6.1.8 6.1.9 6.1.10 6.1.11 6.1.12 6.1.13 6.1.14 6.1.15 6.1.16 6.1.17 6.1.18 6.1.19 4 11 3 3 3 4 2 2 8 3 2 3 3 2 3 2 6.2 溶液配制 6.2.1 5×TBE 缓冲液 称取5.4 g三羟甲基氨基甲烷（6.1.1）、0.372 g 乙二胺四乙酸二钠（6.1.2）和2.75 g硼酸（6.1.3） 溶于70 mL纯水中，定容至100 mL，在103.4 kPa（121℃）条件下灭菌20 min。 6.2.2 0.5×TBE 缓冲液 量取100 mL浓度5×TBE缓冲液（6.2.1）于烧杯中，加入900 mL纯水混匀。 6.2.3 CTAB 提取溶液 称取4 g十六烷基三甲基溴化铵（6.1.4）、16.38 g氯化钠（6.1.5）、1.21 g三羟甲基氨基甲烷（6.1.1）、 1.49 g乙二胺四乙酸二钠（6.1.2）溶于70 mL纯水，定容至200 mL，在103.4 kPa（121℃）条件下灭菌 20 min。 6.2.4 无菌纯水 纯水在103.4 kPa（121℃）条件下灭菌20 min。 2 DB45/T 2171—2020 6.2.5 1%琼脂糖溶液 1 g琼脂糖（6.1.6）溶于100 mL 的0.5×TBE缓冲液（6.2.2），适当加热融化。 6.2.6 10%过硫酸铵溶液 称取10 g过硫酸铵（6.1.7），加入100 mL纯水溶解。 6.2.7 电泳缓冲液 称取108 g三羟甲基氨基甲烷（6.1.1）、7.44 g乙二胺四乙酸二钠（6.1.2）、55 g硼酸（6.1.3）、 0.8 g氢氧化钠（6.1.8），加入10 L纯水溶解。 6.2.8 染色液 称取0.2 g硝酸银（6.1.9），加入400 mL纯水溶解。 6.2.9 显色液 称取4 g氢氧化钠（6.1.8），加入400 mL纯水溶解，临用时再加1.6 mL甲醛（6.1.10）。 7 仪器和设备 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 电子天平：精确至 0.1 mg。 恒温水浴锅。 高速冷冻离心机：最高 15 000 rpm。 PCR 扩增仪。 垂直板电泳系统。 凝胶成像系统。 毛细管电泳仪。 8 SSR 引物序列信息 引物序列信息见附录A。 9 操作步骤 9.1 样品采集 采集或送检的甘蔗青叶片做好标识，于-18℃冰箱中保存备用。 9.2 DNA 的提取 取9.1中适量甘蔗叶片用自来水冲洗干净，再用纯水冲洗两遍，自然晾干后用不锈钢剪刀剪碎放入 研钵中，加入液氮（6.1.11）研磨成粉末状，分取100 mg放入1.5 mL离心管中，加入750 µL CTAB提取溶 液（6.2.3），涡旋振荡混匀后于65℃水浴45 min～60 min，期间每隔15 min颠倒离心管混匀；加入500 µL的三氯甲烷（6.1.12），颠倒混匀，12 000 rpm离心3 min，转移上清液约0.5 mL至新离心管中，加入 等体积（0.5 mL）约4℃的无水乙醇（6.1.13），颠倒混匀，于-18℃冰箱中静置1 h，12 000 rpm 离心 3 min，去上清，室温下干燥至乙醇挥发完全；加入50 µL无菌纯水（6.2.4）于4℃条件下保存备用。 3 — DB45/T 2171 2020 注：以上为推荐的DNA提取方法。其他能够达到PCR扩增质量要求的DNA提取方法也适用于本文件。 9.3 PCR 扩增 9.3.1 PCR 反应体系 反 体 见表1。 PCR 应 系 表1 PCR 反应体系 试剂 终浓度 体积 无菌纯水 - 8.5 µL ×Taq Plus PCR 预混试剂 × 12.5 µL 10 µmol/L 正向引物 0.4 µmol/L 1.0 µL 10 µmol/L 反向引物 0.4 µmol/L 1.0 µL 25 ng/µL DNA 模板 2.0 µmol/L 2.0 µL 2 1 总体积 25.0 µL 9.3.2 PCR 反应程序 ℃预 ℃ 个循环 后7 ℃ 延伸 3 94 变性2 min；94 变性 0 s， ；最 2 下 2 min。 退火30 s（退火温度见附录A推荐引物表），72℃延伸30 s，35 9.4 PCR 产物检测 9.4.1 毛细管电泳检测 9.4.1.1 PCR 产物样品准备 别取 体积 稀释后 附 A 扩增产 溶液混 从混 液 吸取 µL 号加入 LIZ 5 子量 ( ) 到DNA 专 孔板孔 板 各孔 别再加入 µL DNA µL去离子甲酰胺 5 将 在 5℃ 5 取 迅速置 碎冰块 冷却 ～ 5 将整个 孔板置 离 机 离 后放置到DNA 分 等 的 不同引物（ 录 ）PCR 物 合， 合 中 1 按序 分析仪用 00分 内标 6.1.14 和 分析仪 用96 中， 中 分 0.1 8.9 （6.1.1 ）。 样品 PCR仪上9 变性 min， 出， 于 上， 10 min 1 min。 96 于 心 中， 心10 s 分析仪上待检。 9.4.1.2 电泳检测 编辑样品表及运行程序，执行运行程序，仪器自动给出检测结果，保存并记录 按照仪器操作规程， 数据。 9.4.2 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 9.4.2.1 聚丙烯酰胺凝胶制备 在一对玻璃板间插入1.0 mm宽的间隔片，在封口处注入1%琼脂糖溶液（6.2.5），让其凝固密封。 在50 mL量杯中依次加入7.5 mL 5×TBE缓冲液（6.2.1）、7.5 mL 40%丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液(29:1) （6.1.16），搅拌并用纯水定容至30 mL；加入200 µL 10%过硫酸铵溶液（6.2.6）和12 µL四甲基乙二胺 （6.1.17），混匀后倒入凝胶板之间，随即插好样品梳，使其在50 min～60 min内聚合凝固，凝胶高度 应不小于10 cm。 4 DB45/T 2171—2020 9.4.2.2