(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210617654.3 (22)申请日 2022.06.01 (71)申请人 江苏省农业科 学院 地址 211226 江苏省南京市溧水区白马镇 国家农业科技园区江苏省农业科学院 基地 (72)发明人 孙伟波　刘凤权　汤宝　徐剑宏　 赵延存　 (74)专利代理 机构 南京众联专利代理有限公司 32206 专利代理师 张天哲 (51)Int.Cl. C07D 487/08(2006.01) C12P 17/18(2006.01) C12N 1/20(2006.01)A01N 43/90(2006.01) A01P 3/00(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种基于逆流色谱分配技术制备高纯度 HSAF的方法 (57)摘要 本发明公开了一种产酶溶杆菌抗真菌活性 物质HSAF的制备方法及应用， 包括以产酶溶杆菌 发酵液为原料， 利用有机溶剂萃取或大孔吸附树 脂吸附方法获得含有HSAF的粗提物， 采用葡聚糖 凝胶柱净化合并后， 通过逆流色谱分配技术 (CCC)进行分离制备， 分离系统为一定比例的 “正 己烷‑乙酸乙酯 ‑甲醇‑水”组成的混合溶液。 本发 明操作步骤简单， 获得的HSAF产物纯度高， 制备 量大， 稳定性好， 成本低廉， 具有广阔的发展应用 前景。 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 CN 115093420 A 2022.09.23 CN 115093420 A 1.一种基于逆流色谱分配技术制备高纯度HSAF的方法， 其特征在于： 以产生HSAF的野 生菌株产酶溶杆菌或其突变体的发酵液为原料， 利用乙酸乙酯萃 取或大孔吸附树脂吸附获 得粗提物， 采用葡聚糖凝胶柱初步净化后， 通过逆流色谱分配技术CCC进行分离制备， 流分 经吹风静置后获得高纯度HSAF絮状物。 2.根据权利要求1所述的一种基于逆流色谱分配技术制备高纯度HSAF的方法， 其特征 在于： 所述产生HSAF的野生菌株为产酶溶杆菌野生菌或其突变体， 菌株在马铃薯 ‑葡萄糖琼 脂培养基PDA平板上对植物病原真菌产生拮抗活性。 3.根据权利要求1所述的一种基于逆流色谱分配技术制备高纯度HSAF的方法， 其特征 在于： 所述 发酵液的制备方法为挑取平板上的菌株接种于液体NB培养基， 在28℃、 18 0rpm转 速下培养24h， 调节OD600＝1.0， 以体积比1％的比例接入10％TSB培养基或黄豆粉培养基， 发 酵培养48～72h； NB培养基的组成： 蛋白胨5g/L， 蔗糖10g/L， 酵母粉1g/L， 牛肉浸膏3g/L， pH 为7.0； 黄豆粉培养基组成： 葡萄糖8g/L， 黄豆粉8g/L， 氯化钙0.7g/L； 10％TSB培养基组成： 市售TSB粉3g/L； 培 养基于121℃高压蒸汽灭菌20mi n。 4.根据权利要求1所述的一种基于逆流色谱分配技术制备高纯度HSAF的方法， 其特征 在于： 所述粗提物的制备方法为调节发酵液的pH为2.0～4.0， 加入体积比1： 1的乙酸乙酯多 次萃取， 取有机层蒸干后为粗提物； 或发酵结束后加入20g/L的大孔吸附树脂NKA， 摇培12h 进行吸附， 再加入乙醇， 摇培2h多次解吸附， 蒸干后为 粗提物。 5.根据权利要求1所述的一种基于逆流色谱分配技术制备高纯度HSAF的方法， 其特征 在于： 所述粗提物的净化方法为净化填料使用市售的葡聚糖Sephadex  LH‑20凝胶进行装 柱， 洗脱系统为二氯甲烷： 甲醇＝ 1： 1混合或单一溶剂； 湿法上样， 含有HSAF的流分段经高效 液相色谱法HPLC检测合并。 6.根据权利要求5所述的一种基于逆流色谱分配技术制备高纯度HSAF的方法， 其特征 在于： 所述逆流色谱分配技术CCC为将合并的HSAF流分段采用逆流色谱制备， 其中两相溶剂 系统由正己烷 或石油醚： 乙酸乙酯： 甲醇： 水按照体积比2～3： 4～5.5： 3～5： 4～5组成； HSAF 在系统中的分配系数为0.5～2； 以上相为固定相， 下相为流动相， 在离心力的作用下将 HSAF 洗出。 7.根据权利要求6所述的一种基于逆流色谱分配技术制备高纯度HSAF的方法， 其特征 在于： 所述两相溶剂系统由正己烷或石油醚： 乙酸乙酯： 甲醇： 水按照体积比3： 5： 4： 5组成。 8.根据权利要求6所述的一种基于逆流色谱分配技术制备高纯度HSAF的方法， 其特征 在于： 上下相达到平衡状态后注 射样品， 根据318nm和235nm紫外波长的吸收值收集流分， 将 目标流分吹风静置， 析 出白色絮状物即为高纯度HSAF化 合物。 9.根据权利要求8所述的一种基于逆流色谱分配技术制备高纯度HSAF的方法， 其特征 在于： 制备的HSAF化 合物纯度大于95％， 样品回收率大于90％。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115093420 A 2一种基于逆流色谱分配技术制备高纯度HSAF的方 法 技术领域 [0001]本发明属于天然活性产物分离技术领域， 具体涉及一种基于逆流色谱分配技术制 备高纯度HSAF的方法。 背景技术 [0002]天然抗菌化合物的开发和利用在植物病害生物防治领域发挥着重要作用。 产酶溶 杆菌(Lysobacter  enzymogenes)是一类重要的生防细菌， 对多种重要植物病原物表现有拮 抗活性， 对人和植物无害， 有广阔的深入开发应用潜力。 该菌可产生多种抗真菌活性物质， 其中HSAF(Heat  Stable  Antifungal  Factor， 热稳定抗真菌因子， 也称 dihydromaltophilin)是主要活性成分， 化学结构为16元环内酰胺类化合物。 HSAF在0.3～ 1.5 μM浓度下抑制小麦茎基腐病菌、 玉米穗腐病菌、 梨炭疽病菌、 腐烂病菌的生长， 在8～20 μ M时完全抑制小麦赤霉病菌、 水稻稻瘟病菌的生长。 由于抗菌活性强， 对非靶标生物及环境 安全友好， HSAF具有很好的开 发为生物农药的潜力。 而农药开 发和登记需要 大量的标准品， 目前的分离纯化手段主要包括制备型高效液相色谱法(HPLC)、 大孔树脂吸附法等， 前者需 要消耗大量的有机溶剂且制备量较低， 后者的纯度还达不到90％以上， 限制了该化合物的 深入研究和应用。 [0003]逆流色谱技术(Counter  Current Chromatography， CCC)是一种新型的分离纯化 手段， 它是利用样品在固定相和流动相之间的分配系 数差异进行分离， 因逆流色谱的固定 相和流动相都是液体， 因此分离过程没有传统色谱的死吸附， 样品的回收率高。 与HPLC相 比， CCC进样量较大， 最多可达数克， 是HPLC的数百倍； 与常压、 低压色谱相比， CCC技术分离 能力强， 有 些样品经一次分离 即得到1个甚至多个单体， 且分离时间短， 数小时即可完成， 纯 度多在98 ％以上。 此技术己被广泛应用于中药成分分离、 生物化学、 生物工程、 天然产物化 学、 有机合成等领域。 目前尚未有 使用CCC技术分离纯化HSAF的报道或专利。 [0004]本发明提供了一种采用CCC技术分离纯化产酶溶杆菌抗菌活性物质HSAF的方法， 该方法获得的HSAF 纯度在95％以上， 对样品无损失， 分离量大， 有较好的应用前 景。 发明内容 [0005]本发明的目的是提供一种制备高纯度抗菌活性产物HSA F的方法， 该方法制备出的 流分纯度高， 样品回收率高， 分离量大， 分离成本低， 可弥补目前公开专利中溶杆菌活性物 质制备方法的不足， 在天然活性产物分离技 术领域有广泛的应用前 景。 [0006]一般的， 本发明实现的技 术步骤： [0007]以可以产生HSAF的野生菌株产 酶溶杆菌(Lysobacter  enzymogenes)或其突变体 的发酵液为原料， 利用乙酸乙酯萃取或大孔吸 附树脂吸 附获得粗提物， 采用葡聚糖凝胶柱 初步净化后， 通过逆流色谱分配技术(CCC)进行分离制备， 流分经吹风静置后获得高纯度 HSAF絮状物。 [0008]其中， 利用的生防细菌菌株为产酶溶杆菌(Lysobacter  enzymogenes)野生菌或其说　明　书 1/5 页 3 CN 115093420 A 3