(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210694649.2 (22)申请日 2022.06.20 (71)申请人 江苏华水农业发展科技有限公司 地址 223443 江苏省淮安市 涟水县五港镇 (72)发明人 曹春叶　曹凡涛　杨辉　 (74)专利代理 机构 南京纵横知识产权代理有限 公司 32224 专利代理师 刘艳艳 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 1/12(2006.01) C02F 3/34(2006.01) C12R 1/01(2006.01) C12R 1/125(2006.01) C12R 1/38(2006.01)C12R 1/89(2006.01) C02F 101/16(2006.01) (54)发明名称 一种复合 益生菌制剂及其制备方法和应用 (57)摘要 本发明属于微生物 技术领域， 涉及一种复合 益生菌制剂及其制备方法和应用， 本发明的复合 益生菌制剂， 包括枯草芽孢杆菌（ Bacillus   subtilis ）、 副干酪乳酸菌 （ Lactobacillus   p a r a c a s e i ）、沼 泽 红 假 单 胞 菌 （Rhodopseudomonas  palustris ） 和小球藻 （Chlorella ） 。 每单位复合益生菌制剂中， 枯草芽 孢杆菌B.subtilis 、 副干酪乳酸菌 L.paracasei 、 沼泽红假单胞菌 R .palustris 和小球藻 Chlorella 之间的体积配比为4： 3： 1： 2 。 上述复合 益生菌制剂用于降低养殖水体中氨氮和亚硝酸 盐的含量， 能够促进养殖水产动物的生长， 提高 免疫抗病力， 应用范围广泛， 应用效果 好。 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 115093995 A 2022.09.23 CN 115093995 A 1.一种复合益生菌制剂， 其特征在于， 所述复合益生菌制 剂为液体制剂， 包括枯草芽孢 杆菌、 副干酪乳酸菌、 沼泽红假单胞菌和小球藻； 先分别制备枯草芽孢杆菌、 副干酪乳酸菌、 沼泽红假单胞菌和小球藻菌株制剂， 有效活菌数不低于1.0 ×109 CFU/mL， 再按比例将各菌 株制剂复配成复合益生菌， 制备得复合益生菌制剂； 其中， 每单位体积复合益生菌制剂 中， 枯草芽孢杆菌、 副干酪乳酸菌、 沼泽红假单 胞菌和小球藻之间的体积比为 4： 3： 1： 2。 2.根据权利要求1所述的复合益生菌制 剂， 其特征在于， 每单位复合益生菌制 剂中有效 活菌量不低于1.0 ×109 CFU/mL。 3.根据权利要求1或2所述的复合益生菌制 剂， 其特征在于， 所述枯草芽孢杆菌、 副干酪 乳酸菌的扩大培养基为： 红糖200g/L， 尿素5g/L， 酸二氢钾0.5g/L， 七水合硫酸镁0.5 g/L， 胰蛋白胨0.5g/L， 酵母提取物3 g/L； 发酵条件： 温度26 ‑38℃， 搅拌速率100 —150 r/min， 通 气比： 1： 0.4， 培 养时间24— 72h， 培养密度为1.0 ×10 9 ～1013 CFU/mL。 4.根据权利要求1或2所述的复合益生菌制剂， 其特征在于， 所述小球藻BG11的培养基 为： NaNO3 1.5 g/L， K2HPO4 0.04 g/L， MgSO4.7H2O 0.075 g/L， CaCl2.7H2O 0.036 g/L， Na2CO3 0.02 g/L， 柠檬酸 0.006 g/L， 柠檬酸铁 0.006 g/L ， 微量元素溶液 A5 1ml/ L， 溶 解于蒸馏水中， 并在120 ‑122℃下高压灭菌18 ‑22 min， 培养基放置28 ℃恒温光照培养箱进 行培养72 h； 其中A5的成分是H3BO4 2.86 g/L， MnCl2.4H2O 1.81 g/L， ZnSO4 0.222 g/L， Na2MoO4 0.39 g/L， CuSO4.5H2O 0.079 g/L， Co(NO3)2.6H2O 49.4 g/L。 5.根据权利要求1或2所述的复合益生菌制剂， 其特征在于， 所述沼泽红假单胞菌的培 养基为∶ 氯化铵 1 g/L ,碳酸氢钠 1 g/L ,磷酸氢二钾0.2 g/L ,乙酸钠1～5 g/L ,七水 硫酸镁0.2 g/L ,氯化钠0.5～2 g/L ,生长因子10 ml/L,微量元素溶液10 ml/L ,蒸馏水 加至1000 ml， pH 7.0， 放置28 ℃恒温光照培 养箱进行培 养72 h。 6.一种如权利要求1 ‑5任一项所述的复合 益生菌制剂的制备 方法， 其特 征在于， 包括： S1.分别制备草芽孢杆菌、 副干酪乳酸菌、 沼泽红假单胞菌和小球藻的液体制剂： 分别 将各菌株进行发酵培 养， 所得发酵液即为液体制剂； S2.益生菌微生态制剂的制备： 将步骤S1制得的各菌株的液体制剂混合均匀， 即得复合 益生菌制剂。 7.根据权利要求6所述的制备 方法， 其特 征在于， 所述 步骤S1包括： 将枯草芽孢杆菌经36℃ ~ 37℃活化培养12 ~24 h后， 经30℃ ~ 37℃扩大培养48 ~ 72h， 获得 所述枯草芽孢杆菌的液体制剂； 将副干酪乳酸菌经35℃ ~ 37℃活化培养12 ~ 24h后， 经30℃~ 37℃扩大培养48 ~ 72h， 获得 所述副干酪乳酸菌 菌株的液体制剂； 将沼泽红假单胞菌在恒温光照培养箱中28℃， 培养72h， 获得所述沼泽红假单胞菌的 液体制剂； 将小球藻在 恒温光照培 养箱中28℃， 培 养72h获得 所述小球藻的液体制剂。 8.权利要求1 ‑5任一项所述的复合益生菌制剂用于降低水体氨氮、 亚硝酸盐含量的应 用。 9.权利要求1 ‑5任一项所述的复合 益生菌制剂在用于促进鱼体生长中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115093995 A 2一种复合益生菌制剂及其制备方 法和应用 技术领域 [0001]本发明属于微生物技术领域， 涉及一种复合益生菌制剂及其制 备方法和应用， 具 体涉及一种可高效降低养殖 水体氨氮和亚硝酸盐的复合 益生菌制剂。 背景技术 [0002]我国水产养殖产量占世界养殖总产量的七 成以上。 近年来水产养殖环境的污染 日 益加剧， 水产动物疾病爆发、 病原 微生物种类增多、 抗药性增强以及传播速度加快等问题日 益加剧。 在高密度养殖条件下， 常因水质问题影响水产动物健康生长， 病害时有发生， 限制 水产养殖业的可持续健康发展， 并且在淡水养殖的过程中， 水塘中也经常会出现氨氮和亚 硝酸盐水质指标超标。 [0003]氨氮和亚硝酸盐水质指标超标一方面可造成水体富营养化， 另一方面影响水产生 物的生长、 降低其对不良环境及 疾病的抵抗能力， 成为诱 发病害的主要原因， 影响水产养殖 生产。 氨氮和 亚硝酸盐超标是水产养殖环境的主要胁迫因子， 常规模式调节水质通常是换 水调节， 浪费了大量的水资源， 与我国淡水资源匮乏的现状相矛盾， 且养殖成本高。 发明内容 [0004]为解决上述技术问题， 本发明提供了一种复合益生菌制剂及其制 备方法和应用， 该复合益生菌可以高效降低水体氨 氮和亚硝酸盐含量。 [0005]本发明的技 术方案如下： 第一方面， 提供一种复合益生菌制剂， 所述复合益生菌制剂为液体制剂， 包括枯草 芽孢杆菌、 副干酪乳酸菌、 沼泽红假单胞菌和小球藻； 先分别制备枯草芽孢杆菌、 副干酪乳 酸菌、 沼泽红假单胞菌和小球藻菌株制剂， 有效活菌数不低于1.0 ×109 CFU/mL， 再按比例 将各菌株制剂复配成复合益生菌， 制备得复合益生菌制剂； 其中， 每单位体积复合益生菌制 剂中， 枯草芽孢杆菌、 副干酪乳酸菌、 沼泽红假单 胞菌和小球藻之间的体积比为 4： 3： 1： 2。 [0006]其中所述枯草芽孢 杆菌Bacillus  subtilis ， 购买于上海沪震生物科技有限公司， 货号HZ0098的甘油菌产品； 副干酪乳酸菌 Lactobacillus  paracasei ， 购买于上海保藏生物技术中心， 产品编 号为NRIC1005。 [0007]沼泽红假单胞菌 Rhodopseudomonas  palustris ， 购买于商城北纳创联生物科技有 限公司， 产品编号 为BNCC232041。 [0008]小球藻Chlorella， 购买于生物风资源技 术服务有限公司， 产品编号 为ATCC14853。 [0009]在一些实施例中， 所述的复合益生菌制剂， 每单位复合益生菌制剂中有效活菌量 不低于1.0 ×109 CFU/mL。 [0010]在一些实施例中， 所述枯草芽孢杆菌、 副干酪乳酸菌的扩大培养基为： 红糖200g/ L， 尿素5g/L， 酸二氢钾0.5g/L， 七水合硫酸镁0.5  g/L， 胰蛋白胨0.5g/L， 酵母提取物3  g/L； 发酵条件： 温度2 6‑38℃， 搅拌速率100— 150 r/min， 通气比： 1： 0.4， 培养时间24—72h， 培养说　明　书 1/4 页 3 CN 115093995 A 3