ICS 65.020.20 B 05 备案号： 江 DB32 苏 省 地 方 标 准 DB32/T 3627—2019 菊花种质资源离体保存技术规程 Technical Regulation for conservation of chrysanthemum germplasm in vitro 2019-07-11 发布 江苏省市场监督管理局 2019 -08-01 实施 发 布 DB32/T 3627—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由南京农业大学提出并归口。 本标准起草单位：南京农业大学、南京华之彩园艺有限公司。 本标准主要起草人：房伟民、陈发棣、管志勇、蒋甲福、王海滨、邓波、范志欣。 I DB32/T 3627—2019 菊花种质资源离体保存技术规程 1 范围 本标准规定了菊花种质资源离体保存的术语和定义、基本要求和常温生长离体保存、低温生长离体 保存、超低温离体保存方法及再生与检测方法等。 本标准适用于菊花种质资源的离体保存，菊属其他种质资源保存可参照执行。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 1491 花卉植物病毒检测规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 常温离体保存 conservation at room temperature in vitro 在常温（25℃±2℃）下保存正常生长的离体保存物的方式。 3.2 低温离体保存 conservation at low temperature in vitro 通过低温条件、改变培养基成分或添加抑制型植物生长调节物质等手段以延缓保存物生长速度的离 体保存方式。 3.3 超低温离体保存 cryopreservation 在液氮（-196℃）中保存离体材料，使之代谢和生长基本停止，生物学状态相对稳定的离体保存方 式。 4 材料要求 4.1 基本要求 保存的材料应符合以下要求： a）用于保存的材料应该保证品种纯正，来源可靠，基本性状清楚，且未发生变异。 1 DB32/T 3627—2019 b) 依据D NY/T 1491 规定的方法进行病毒检测，确保材料不携带菊花B病毒（CVB）、番茄不孕 病毒（TAV）、菊花矮化类病毒（CSVd）、菊花褪绿斑驳类病毒（CChMVd）等。 4.2 材料登记要求 保存的材料应进行信息登记，内容包括种质名称或编号、产地或产权单位（人） 、引种情况、保存 情况等（见附录A）。 5 常温离体保存 5.1 保存材料 选择符合 4.1 条件的材料并按照 4.2 要求详细登记，利用生根培养 30 d 左右、生长整齐一致的无菌 苗为材料，切割成带 2 个～3 个节的茎段供保存。 5.2 保存容器 采用规格为直径(18～30) mm×长(160～200) mm的试管，用内置硅胶圈的密封塑料盖或封口膜封 口，贴好标注保存编号的标签。 5.3 保存条件 MS 培养基均附加 0.3 mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA、30 g/L 蔗糖和 7 g/L 琼脂，pH 6.0。置于温度 （25±2）℃、光照强度 2000 lx～3000 lx、光照时间 12 h/d 的条件下培养。每管加培养基 15 mL～25 mL。 5.4 保存数量 每份种质5管以上，每管1个～2个茎段。 5.5 继代时间 视不同种质的生长速度，每2个～3个月继代1次。 5.6 技术指标 变异率≤2%；无菊花B病毒（CVB）、番茄不孕病毒（TAV）、菊花矮化类病毒（CSVd）、菊花褪绿 斑驳类病毒（CChMVd） 。 6 低温离体保存 6.1 保存材料 同 5.1。 6.2 保存容器 同 5.2。 6.3 保存条件 根据种质特点，下列两种方法可以选用一种: a) 减少培养基养分水平法：低温（5±2）℃下，1/4MS 或 1/2MS+0.3 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L 2 DB32/T 3627—2019 蔗糖+7 g/L 琼脂，该方法适宜地被、盆栽型菊花种质资源。 b) 添加抑制型植物生长调节物质法：低温（5±2）℃下，MS+0.3 mg/ 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖+7 g/L 琼脂，培养基中添加 20 mg/L～80 mg/L ABA，或者 15 g/L～20 g/L 甘露醇；地被、盆栽型 资源宜添加低剂量 ABA 或甘露醇，切花型资源宜采用较高剂量。 6.4 保存数量 同 5.4。 6.5 继代时间 视不同种质的生长速度，每8个～12个月继代1次。 6.6 技术指标 变异率≤2%；无菊花B病毒（CVB）、番茄不孕病毒（TAV）、菊花矮化类病毒（CSVd）、菊花褪绿 斑驳类病毒（CChMVd） 。 7. 超低温离体保存 7.1 保存材料 选择符合4.1条件的材料并按照4.2要求详细登记，利用生根培养30 d左右、生长整齐一致的无菌苗 为材料，切成0.5 cm～1 cm，含2个以上腋芽，在MS培养基附加30 g/L 蔗糖和7 g/L 琼脂，pH 6.0，温度 （25±2）℃、光照强度2000 lx～2500 lx、光照时间16 h/d，培养2 w～3 w。 7.2 保存容器 采用规格为直径(15～20)mm×长(120～160) mm试管，用内置硅胶圈的密封塑料盖，贴好标注保 存编号的标签。 7.3 分离茎尖 在无菌条件下，通过解剖镜逐层剥去外层叶片,切取1 mm～2 mm大小的茎尖。 7.4 保存数量 每份种质5管以上，每管8个～10个茎尖。 7.5 预培养 茎尖分别接种到含 0.4 mol/L 蔗糖浓度的 MS 培养基内，4℃暗培养 3 d。 7.6 装载 将无菌棉纸放置在培养皿中，用装载溶液(附录B)湿润。将8个～10个菊花茎尖包在棉纸中，迅速浸 入装载溶液中，室温（25±2）℃下暗处理30 min，取出后用无菌滤纸吸去多余装载液。 7.7 脱水 将包有茎尖的棉纸团转入玻璃化保护剂PVS2（附录B），冰浴条件下处理15 min。 7.8 冷冻保存 3 DB32/T 3627—2019 将脱水（玻璃化）处理后包有茎尖的棉纸团转移至装有预冷新鲜玻璃化试剂PVS2的冷冻管中,密封 塑料盖并用封口膜封口，迅速投入液氮中保存。 7.9 技术指标 冻后再生率≥20%，变异率≤1%；无菊花 B 病毒（CVB）、番茄不孕病毒（TAV）、菊花矮化类病 毒（CSVd）、菊花褪绿斑驳类病毒（CChMVd）。 8. 再生与检测 8.1 超低温保存材料的再生 8.1.1 化冻 在无菌条件下，快速将冷冻管从液氮转移至40℃水浴中，剧烈震荡120 s。然后将包有茎尖的棉纸 团从冷冻管取出，在经灭菌的干燥滤纸放置30 s。 8.1.2 卸载 将化冻后包有茎尖的棉纸团转移到卸载液（附录B），室温（25±2）℃下放置10 min，中间5 min 时换一次卸载液。然后将棉纸团展开，茎尖在卸载液中悬浮5 min。 8.1.3 再生 用含蔗糖 1.2 mol/L 的 MS 液体培养基洗涤 20 min,滤纸吸干后接种到含 0.1 mg/L BA 和 0.01 mg/L NAA 的 MS 固体或半固体培养基中,在（25±2）℃条件下暗培养或弱光培养 1 d～3 d 后转入正常光照培 养条件下培养 2-3 周。 8.2 检测 8.2.1 病毒检测 保存再生后代的病毒检测按照 NY/T 1491 的方法进行。 8.2.2 变异率检测 取定植 2 个月后植株心叶，CTAB 法提取 DNA，采用 20.0µL PCR 反应体系，包括 10×Buffer 2.0 µL， ＋ 5mmol/L Mg2 1.5 µL，10 mmol/L dNTP Mixture 0.8 µL，5U/µl Taq 酶 0.2 µL，20 µmol/L ISSR 随机扩 增引物 0.5 µL，ddH2O 13.0 µL，模板 DNA 2.0µL。所用的扩增反应程序为 95℃预变性 5 min，94℃变性 45 s；53℃复性 40 s；72℃延伸 70s，45 个循环，72℃延伸 7 min，最后 4℃保存。电泳结束后凝胶成像 系统分析仪中观察并拍照，比较离体保存苗与对照苗的条带差异。 4 DB32/T 3627—2019 附录 A （资料性附录） 菊花种质资源离体保存登记表 表 A.1 菊花种质资源离体保存登记表 种质名称或 种质名称或 编号（中文） 编号（英文） 其他名称 原产地或 来源地或 产权单位（人） 引种单位 引种单位 引种人 引种时间 引种数量 采集号或引种号 保存号 保存方法 保存时间 保存数量 保存者 继代次数 继代时间 保存数量 操作人 5 DB32/T 3627—2019 附录 B （资料性附录） 菊花种质超低温离体保存溶液的配制 B.1 装载液 MS 培养基＋184ml/L 甘油＋137g/L 蔗糖，pH 5.8，0.22µm 滤膜过滤灭菌。 B.2 PVS2 溶液 MS 培养基＋300ml/L 甘油＋150ml/L 乙二醇＋150ml/L 二甲基亚砜（DMSO） ＋137g/L 蔗糖， pH 5.8， 0.22µm 滤膜过滤灭菌。 B.3 卸载液 MS 培养基＋411g/L 蔗糖，pH 5.8，0.22µm 滤膜过滤灭菌。 _________________________________ 6