ICS 65.020.20 B 05 DB14 山 西 省 地 方 标 准 DB 14/ T 1515—2017 食用百合脱毒试管苗繁育技术规程 2017 - 12 - 10 发布 山西省质量技术监督局 2018 - 02 - 10 实施 发 布 DB14/ T 1515—2017 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 生产设施和仪器设备 ................................................................ 2 5 培养基 ............................................................................ 2 6 环境消毒和无菌操作 ................................................................ 2 7 脱毒母株的获取 .................................................................... 3 8 脱毒试管苗鳞茎的诱导和增殖 ........................................................ 3 9 脱毒试管鳞茎生根 .................................................................. 4 10 脱毒试管鳞茎的移栽 ............................................................... 4 I DB14/ T 1515—2017 前 言 本标准按照BG/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山西农业大学提出并归口。 本标准起草单位：山西农业大学。 本标准主要起草人：赵娟、温银元、尹美强、张彬、王计平、宋喜娥、董淑琦、原向阳、王玉国、 郭平毅。 II DB14/ T 1515—2017 食用百合脱毒试管苗繁育技术规程 1 范围 本标准规定了食用百合脱毒试管苗（鳞茎）繁育的生产设施和仪器设备、培养基、环境消毒和无菌 操作、脱毒母株的获取、脱毒试管苗鳞茎的诱导和增殖、脱毒试管鳞茎生根及脱毒试管鳞茎的移栽。 本标准适用于食用百合脱毒试管苗的繁育。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 1491 花卉植物病毒检测规程 NY/T 1744 切花百合脱毒种球 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 脱毒试管苗 在无菌条件下，应用茎尖组织培养技术获得，不带LSV（百合无症病毒）、CMV（黄瓜花叶病毒）、 LMoV（百合斑驳病毒）病毒的，在封闭容器内繁殖的种苗。 3.2 鳞片 着生在鳞茎盘上的叶基或者叶鞘膨大而成的变态叶。 3.3 鳞茎 在短缩茎盘省着生的肉质叶鞘膨大而成的变态器官。 3.4 脱毒试管鳞茎 无菌条件下，在封闭培育容器内由脱毒试管苗诱导形成的鳞茎。 3.5 1 DB14/ T 1515—2017 籽球 通过组培苗或鳞片繁殖形成的周长小于 3 cm 的小鳞茎。 4 生产设施和仪器设备 4.1 生产设施 准备室、无菌室、培养室、检测室、温室等。 4.2 主要仪器设备 超净工作台、压力蒸汽灭菌锅、鼓风干燥箱、光照培养箱、人工气候箱、冰箱体式显微镜（双筒 解剖镜）、空调、照度计、自动控时器、温湿度计、酶标仪、高速冷冻离心机、电泳仪、电泳槽、PCR 仪、微量移液器、电子天平、pH计、磁力搅拌器、电冰箱、移液枪、各种培养容器等。 5 培养基 选用MS培养基（Murashige﹠Skoog(1962)）为基本培养基。 5.1 MS 培养基母液的配制 按MS培养基标准成分配制。配制母液时，大量元素、微量元素、铁盐各成分依次加热溶解后混合， 冷却后定容，铁盐需装入棕色试剂瓶。各母液配制好后均放置在冰箱中4 ℃条件下保存，使用时根据培 养基配制量取适量母液。 5.2 植物生长调节剂母液的配制 植物生长调节剂配制成浓度为0.5 mg/mL～1 mg/mL的母液。配制时，先用1 mL～2 mL95%乙醇溶解 （溶解IBA、NAA）或0.1 mol/L的HCl（溶解6-BA、KT）溶解，再用无菌蒸馏水定容至所需浓度，摇匀后 贮于棕色试剂瓶中，置于4 ℃冰箱中保存。 5.3 培养基的制备 配制时，先将培养基基本成分（大量元素、微量元素、铁盐、有机物）按照需要量加入量筒中，再 分别加入不同浓度需用量的各种激素，定容后加入糖和琼脂，放入蒸煮锅内煮开，用0.1 mol/L的HCl 或NaOH调节pH值至5.6～5.8，分装于试管或三角瓶等容器中，用封口膜（盖）封口，放入高压蒸汽灭菌 2 锅中进行灭菌。灭菌时工作压力稳定在1.1 kg/cm （0.105 MPa），温度为121 ℃，灭菌时间20 min。 灭菌后置于试管架或存放架上冷却待用。 6 环境消毒和无菌操作 6.1 环境消毒 接种前，提前30 min开启无菌室室内和超净工作台紫外灯照射消毒，关灯后15 min～20 min工作人 员方可进入室内操作。室内若有浮尘，可用75%乙醇或1%苯扎溴铵溶液（新洁儿灭消毒液）喷雾降尘。 每天工作结束后，清扫地面，可用有效氯含量5%～6%的次氯酸钠（NaClO）溶液（84消毒液）500 mg/L～ 1 000 mg/L，或将27 g/L～33 g/L苯扎溴铵溶液稀释10倍，或用50%多菌灵400倍液等交替进行地面消毒。 2 DB14/ T 1515—2017 接种服、工作帽、口罩、拖鞋等在消毒柜中消毒或用紫外灯照射消毒。操作所用的镊子、解剖刀、 解剖针、培养皿等均需用纱布或牛皮纸包裹后，经过高压蒸汽灭菌，培养皿及滤纸可用牛皮纸包好置于 鼓风干燥箱内200 ℃下灭菌2 h。 6.2 无菌操作 工作人员进入接种室前，需用肥皂清洗手臂，在更衣室穿好消毒过的接种服、工作帽、口罩和拖鞋 （鞋套） 。操作时用 75%乙醇仔细擦拭双手、超净工作台台面。将镊子、接种刀等接种工具浸泡在 95% 乙醇中，使用前，在酒精灯外焰上灼烧灭菌后（也可用消毒器代替酒精灯） ，置于搁置架上冷却待用， 在操作中接种工具要重复进行灭菌。 7 脱毒母株的获取 7.1 外植体 选择外观无病毒症状的植株，以其饱满、无病虫害、无损伤的健康鳞茎为脱毒培养材料，取中心 茎尖为外植体。 7.2 鳞茎灭菌 用自来水冲洗鳞茎表面泥土，剥离鳞茎外层鳞片，以周长小于1 cm的鳞茎为外植体，放入烧杯中， 移至超净工作台上，先用75%乙醇（酒精）浸泡10 s～30 s，再用10% NaClO灭菌处理12 min，之后用无 菌水冲洗4～5次，再用无菌滤纸吸去表面水分，置于无菌培养皿中备用。 7.3 茎尖剥离 将灭过菌的鳞茎置于 40 倍体式显微镜（双筒显微镜）下，用解剖针由外向内剥去鳞片，直至露出 光滑的茎尖，用解剖刀切取 0.5 mm～1 mm 的茎尖，接种于 MS+6-BA 0.5 mg/L～1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+3%蔗糖培养基中，封口后，在培养瓶壁上标注编号、接种日期等。 7.4 茎尖培养 把接种后的培养瓶放在培养室内的光照培养架上进行培养。培养条件为温度(25±2)℃，光照强度 2 000 Lx～3 000 Lx，光照时间 14 h～16 h/d。培养 30～40 d 后，可看到茎尖明显伸长且呈绿色，继 续培养诱导茎尖萌动成苗。 7.5 试管苗病毒检测 随机挑选100份百合茎尖脱毒苗，分别用DAS-ELISA或者TR-PCR法对其进行LSV、CMV和LMoV三种病毒 的检测，按照NY/T 1744-2009中的5.1、5.2、6.1、6.2和6.3的规定执行，筛选出无病毒的试管苗。 8 脱毒试管苗鳞茎的诱导和增殖 8.1 脱毒试管苗鳞茎的诱导 病毒检测后获得的脱毒百合试管苗培养30 d后，将增殖的芽丛切下，转入鳞茎诱导培养基。培养基 成分为1/2MS基本培养基，附加NAA0.5 mg/L～1.0 mg/L，蔗糖浓度为60 g/L～100 g/L，pH5.6～5.8。 3 DB14/ T 1515—2017 30～40 d后分化出小鳞茎。培养条件为培养温度（25±2）℃，光照强度2 000 Lx～3 000Lx，光照时间 14 h～16 h/d。 8.2 脱毒试管鳞茎扩繁 将诱导产生的试管鳞茎接种于MS+6-BA 0.2 mg/L～1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L～0.5 mg/ L+6%～10% 蔗糖培养基中，诱导小鳞茎增殖。培养30～40 d后，再转接于MS+ZT 1.0 mg～3.0 mg/L+IBA 0.5 mg～ 1.0 mg/L+8%～10%蔗糖培养基中，诱导鳞茎增殖膨大，获得健壮鳞茎，用于生根培养。培养条件同8.1。 9 脱毒试管鳞茎生根 9.1 试管鳞茎生根 将增殖培养获得的脱毒鳞茎接种于1/2MS+NAA 0.1 mg～0.5 mg/L+6%～10%蔗糖培养基中，诱导鳞 茎生根。培养条件为温度（22±2）℃，光照强度2 000 Lx～3 000Lx，光照时间14 h～16 h/d。 9.2 试管鳞茎出瓶标准 试管内生根鳞茎直径达到0.5 cm～1 cm。 9.3 病毒检测 脱毒试管鳞茎的抽样和病毒检测同7.5。 10 脱毒试管鳞茎的移栽 10.1 炼苗 移栽前将达到出瓶标准的试管鳞茎放置于培养室黑暗处10～15 d，移栽前1周置于温室闭瓶炼苗， 移栽前2～3 d温室开瓶炼苗。 10.1 移栽基质 移栽基质用蛭石、沙、土1：2：3比例混合均匀，或用腐叶土、蛭石1：1比例混合基质，基质厚度 10 cm～15 cm。 10.2 移栽技术 2 温室移栽时，用清水将试管鳞茎根部的培养基洗干净后，