ICS 65.150 B 52 DB35 福 建 省 地 方 标 准 DB35/T 1354—2013 罗非鱼无乳链球菌病双重 PCR 诊断规程 Diagnostic protocols of tilapia infected with streptococcus agalactiae by duplex polymerase chain reaction 2013-08-01 发布 福建省质量技术监督局 2013-11-01 实施 发 布 DB35/T 1354—2013 前 言 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准按照GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则编写。 本标准由福建省海洋与渔业厅提出并归口。 本标准负责起草单位：福建省淡水水产研究所、顺昌县水产技术推广站。 本标准主要起草人：樊海平、吴斌、张新艳、邓志武、郑磊、钟全福、曾占壮。 I DB35/T 1354—2013 罗非鱼无乳链球菌病双重 PCR 诊断规程 1 范围 本标准规定了罗非鱼无乳链球菌病的术语和定义、流行情况与主要症状、样品采集与处理、双重PCR 检测和诊断。 本标准适用于罗非鱼无乳链球菌病的诊断、流行病学调查、检疫与监测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SC/T 7014-2006 水生动物检疫实验技术规范 SC/T 7103-2008 水生动物产地检疫采样技术规范 SC/T 7202.2-2007 斑节对虾杆状病毒病诊断规程 第2部分：PCR检测法 3 术语和定义 下列术语与定义适用于本文件。 3.1 罗非鱼无乳链球菌病 streptococcosis of tilapia infected by streptococcus agalactiae 罗非鱼受无乳链球菌感染，发生病理变化，出现行为异常或死亡。 4 试剂与溶液 4.1 无乳链球菌 16S rRNA 基因部分序列引物： ——F1：5'-TTTGGTGTTTACACTAGACTG-3'，浓度10 µmol/L，-20 ℃保存； ——R1：5'-TGTGTTAATTACTCTTATGCG-3'，浓度10 µmol/L，-20 ℃保存。 4.2 无乳链球菌 sip(表面免疫相关蛋白)基因序列引物： ——F2：5'-ATGAAAATGAATAAAAAGGTACTATTG-3'，浓度10 µmol/L，-20 ℃保存； ——R2：5'-TTATTTGTTAAATGATACGTGAACA-3'，浓度10 µmol/L，-20 ℃保存。 4.3 溶菌酶（100 µg/mL）：生化试剂，-20 ℃保存。 4.4 蛋白酶 K(100 µg/mL)、NaCl（3 mol/L）、裂解缓冲液和 SYBR GreenⅠ工作液按附录 A 的规定配 制。 4.5 DNA 分子量标准（0.1 kb～1.5 kb）：生化试剂，-20 ℃保存。 4.6 阳性对照：无乳链球菌标准株的 DNA 模板，-20 ℃保存。 4.7 阴性对照：已知无乳链球菌阴性的罗非鱼组织样品 DNA 模板，-20 ℃保存。 4.8 空白对照：无菌双蒸水为空白模板。 1 DB35/T 1354—2013 4.9 除上述试剂与溶液外，其余按 SC/T 7202.2-2007 第 5 章的规定执行，实验室用水符合 SC/T 7014-2006 中第 5 章的规定。 5 仪器与设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 5.10 PCR 扩增仪:配备 25 µL 和 50 µL 的 PCR 反应底座。 凝胶成像仪：可发射紫外线，携带摄影系统。 电泳仪：输出直流电压 0 V～400 V，直流电流 1 mA～500 mA。 水平电泳槽：容量 250 mL～650 mL，带凝胶板、样孔梳。 台式离心机：配置 1.5 mL 转子，转速 16 000 r/min 以上。 电动组织研磨器：转速 500 r/min～5 000 r/min。 2 研磨棒：1.05 Kg/cm 、121.3 ℃高压蒸气灭菌 15 min。 2 离心管：容量 1.5 mL，1.05 Kg/cm 、121.3 ℃高压蒸气灭菌 15 min。 2 PCR 反应管：25 µL 和 50 µL，1.05 Kg/cm 、121.3 ℃高压蒸气灭菌 15 min。 除上述仪器设备外，其余按 SC/T 7202.2-2007 第 6 章的规定执行。 6 流行情况与主要症状 6.1 流行情况 该病流行于春、夏和秋季，高峰期为 5 月～9 月，水温 25 ℃～37 ℃，传染性强，主要危害 100 g 以上的罗非鱼，也可感染体长 1 cm～3 cm 的苗种。 6.2 主要症状 患病罗非鱼摄食减少，游动迟缓，失去平衡，常在水上层侧游打转；眼球突出并伴随眼底出血和晶 状体浑浊；鳃盖内侧发红、充血或出血；下颌、体侧、腹部以及各鳍条基部出血；肝脏、胆囊和脾脏肿 大；肠黏膜充血；肠道和腹腔积液。 7 样品采集与处理 7.1 采样 按 SC/T 7014-2006 第 6 章的规定执行。 7.2 样品封存、运输、登记与保存 按 SC/T 7103-2008 第 9 章、第 10 章、第 11 章和第 12 章的规定执行。 8 双重 PCR 检测 8.1 DNA 模板的制备 8.1.1 DNA 提取的环境 应符合 SC/T 7014-2006 附录 B 的规定，在样品区完成。 8.1.2 样品准备 2 DB35/T 1354—2013 无菌解剖采集肾脏或脾脏组织 50 mg～100 mg，放入 1.5 mL 离心管中，在无菌条件下，电动研磨 器，3 000 r/min 研磨至匀浆状。 8.1.3 裂解 于研磨样品中加入溶菌酶 50 µL，37 ℃裂解 1 h；分别加入裂解缓冲液 200 µL 和蛋白酶 K 25 µL， 55 ℃裂解 1 h。 8.1.4 DNA 的提取 裂解样品 16 000 r/min 离心 10 min；取上清液于 1.5 mL 离心管中，加等体积的酚-氯仿-异戊醇 混合液，颠倒混匀 8 min，16 000 r/min 离心 10 min；取上层液体于 1.5 mL 离心管中，加 1/10 体积 的 3 mol/L NaCl，2.5 体积的无水乙醇，颠倒混匀 5 min，-20 ℃ 放置 30 min，16 000 r/min 离心 10 min；弃上清液，加入 70％乙醇 500 µL，重悬沉淀，16 000 r/min 离心 5 min；弃上清液，常温干 燥 10 min；加 TE 缓冲液 30 µL，制成 DNA 提取液，-20 ℃保存备用。 8.2 反应体系的准备 PCR 反应可选择 25 µL、50 µL 反应体系进行。按表 1 的要求，加入除 TaqDNA 聚合酶以外的各项试 剂，配制成无酶反应预混物。按检测 PCR 反应体系的 1 份/支或 100 份/支分装，-20 ℃保存。在临用前， 根据所需的反应份数，取出无酶反应预混物，加入相应体积的 TaqDNA 聚合酶和待测样品模板混匀，即 为完全的反应预混物，按 1 份/支分装到 0.2 mL PCR 管中。 表1 PCR 反应所需试剂组成 试剂 25 µL 反应体系 50 μL 反应体系 试剂终浓度 10×PCR 缓冲液 2.5 µL 5.0 µL 1× 氯化镁（25 mmol/L） 3.0 µL 6.0 µL 3 mmol/L dNTP （10 mmol/L） 1.0 µL 2.0 µL 200 µmol/L 引物 F1（10 µmol/L） 0.5 µL 1.0 µL 0.08 µmol/L 引物 R1（10 µmol/L） 0.5 µL 1.0 µL 0.08 µmol/L 引物 F2（10 µmol/L） 1.0 µL 2.0 µL 0.32 µmol/L 引物 R2（10 µmol/L） 1.0 µL 2.0 µL 0.32 µmol/L 灭菌双蒸水 14.4 µL 28.8 µL TaqDNA 聚合酶（5 U/μL） 0.1 µL 0.2 µL 1 份反应总体积 25.0 µL 50.0 µL — 100 份反应总体积 250.0 µL 500.0 µL — — 0.02 U/µL 注：每25.0 µL体系模板量1.0 µL；每50.0 µL体系模板量2.0 µL。 8.3 双重 PCR 扩增 8.3.1 按表 1 各反应体系所需的模板体积要求，在含有反应物的 PCR 管中分别加入相应体积的各样品 DNA 模板。并设阳性对照、阴性对照和空白对照。每个样品制备 3 个平行样。 3 DB35/T 1354—2013 8.3.2 将含有反应物的 PCR 管置于 PCR 仪反应槽中，按以下程序进行扩增：94 ℃预变性 5 min， （94 ℃变性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃ 延伸 1.0 min）×35 个循环，72 ℃延伸 10 min，最后 16 ℃ 保温，准备进行产物的电泳。 8.4 琼脂糖凝胶的制作 8.4.1 用 1×电泳缓冲液配制 1％的琼脂糖凝胶，加热至溶液完全透明。 8.4.2 将凝胶液缓缓倒入放置好样孔梳的凝胶板，胶液厚度 0.6 cm～0.8 cm。样孔梳底部水平深入凝 胶层 0.3 cm～0.5 cm，并距凝胶底部 0.2 cm。 8.4.3 待凝胶完全凝固后，拔掉样孔梳，即可用于电泳。 8.5 电泳 8.5.1 将琼脂糖凝胶放入水平电泳槽，加样孔朝向负极，加入 1×电泳缓冲液没过胶面 0.1 cm～0.2 cm。 8.5.2 10 µL PCR 扩增产物加入 1.3 µL SYBR GreenⅠ工作液和 2 µL 6×载样缓冲液混匀，室温放置 10 min 后加到加样孔中。同时设一个泳道加入 5 µL DNA 分子量标准物。 8.5.3 盖上电泳槽后通电，在 1 V/cm～5 V/cm 下电泳 30 min，当载样缓冲液中的溴酚蓝指示剂的色 带迁移至琼脂糖凝胶的 1/2～2/3 处时停止电泳，将凝胶置于凝胶成像仪上观察与拍照。 8.6 分子量计算 按 SC/T 7202.2-2007 中 7.1.7 的规定执行。 8.7 结果判定 8.7.1 检测样品和阳性对照在 121 bp 和 1 305 bp 处均有二条特定条带出现（参见附录 B）；阴性对 照在 121 bp 和