ICS 65.020 CCS B 61 团 体 标 准 T/JSHS 004-2022 葡萄苗木成活率与生长势早期快速精准鉴 定技术规程 A technical regulation for early, rapid and accurate identification of survival rate and growth vigor of grape seedling 2022－05－13发布 2022－05－13实施 江苏省园艺学会 发布 JSHS 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/JSHS 004-2022 I 目 次 前 言 ................................ ................................ ................................ ................................ .............................. II 1 范围 ................................ ................................ ................................ ................................ ................................ .. 1 2 规范性引用文件 ................................ ................................ ................................ ................................ .............. 1 3 术语和定义 ................................ ................................ ................................ ................................ ...................... 1 4 葡萄苗木成活率与生长势鉴定 ................................ ................................ ................................ ...................... 2 5 葡萄苗木成活率与生长势判断 ................................ ................................ ................................ ...................... 3 附 录 A ................................ ................................ ................................ ................................ ............................. 5 全国团体标准信息平台 T/JSHS 004-2022 II 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 -2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》给出的规 则编写。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由 南京农业大学 提出。 本文件由江苏省 园艺学会归口。 本文件起草单位： 南京农业大学、江苏省农业技术推广总站 。 本文件主要起草人： 房经贵、陆爱华、裴丹、郑婷、卢素文 。 全国团体标准信息平台 T/JSHS 004-2022 1 葡萄苗木成活率 与生长势早期快速精准鉴定技术规程 1 范围 本文件规定了 通过检测 葡萄看家基因 表达情况提早鉴定 葡萄苗木 成活率与生长势的快速技术。 本文件适用于 巨峰、夏黑、阳光玫瑰等 葡萄苗木 成活率与生长势的鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 NY/T 469 葡萄苗木 DB15/T 24 -2019 葡萄苗木质量 LY/T 2418 -2015 苗木检测抽样方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 苗木成活率 seedling survival rate 苗木成活率 是用于衡量 苗木冬芽萌发的指标 ，具体指 冬芽可以萌发 的活树苗占总树苗的百分比 。 3.2 苗木生长 势 seedling growth vigor 苗木生长势是苗木生长发育的旺盛程度，如新梢生长长度、粗度和叶片大小等。 3.3 葡萄冬芽 grapevine winter bud 葡萄冬芽是落叶后的枝条上 着生的 /保留的继续活动的 芽结构，其被冬芽鳞片包裹后可抵御外界寒 冷、干燥等不利条件。 冬芽能否安然度过 寒冬季节以及冬季环境对于冬芽的影响 ，决定了葡萄苗木的成 活率与生长势。这与冬芽 的形态结构以及内部生理变化有 着直接关系。 3.4 看家基因 house keeping gene ，HKG 看家基因是维持细胞最低限度功能所 必不可少的基因，如肌动蛋白（ Actin）基因等。这类基因在 所有类型的细胞中都进行表达， 因为这些基因的产物对于维持细胞的基本结构和代谢功能是必不可少的。 3.5 半定量 PCR semi-quantitative PCR 全国团体标准信息平台 T/JSHS 004-2022 2 半定量 PCR，是指从传统的 PCR定性分析方法基础上发展 而来，在固定 PCR循环数下进行，使 总 cDNA浓度保持在 PCR指数期， 能够测定目标产物相对 扩增量的 PCR技术。 4 葡萄苗木 成活率与生长势鉴定 4.1 样品准备 4.1.1 从一批待测葡萄苗木中随机选取 20株进行取样， 具体样本量参照 LY/T 2418 -2015 苗木抽样方 法。分别选取其由下至上的第 1 ~ 4个冬芽作为葡萄苗木 成活力检测的样品。 图1 幼苗保留节位及冬芽节位次序 4.1.2 用锋利的刀片将芽切下后，每个芽单独存放于 1.5 ml离心管中，管盖及侧面均用马克笔标号 并在记录本做记录，经液氮冷冻后储存于 -80 ° C冰箱。 4.2 鉴定前准备 4.2.1 引物合成 ：看家基因为包括肌动蛋白（ ACT，GenBank 登录号： EC969944 ），泛素（ UBQ， GenBank 登录号： EC929411 ），甘油醛 3-磷酸脱氢酶（ GAPDH，GenBank 登录号： AT1G13440.1 ），具 体信息见附录 A；合成后的干粉用 ddH 2O稀释至 10 μM。 4.2.2 药品准备：液氮、 焦碳酸二乙酯 （DEPC）、 ddH 2O、琼脂糖、溴化乙锭、 10×TBE缓冲液、 PCR Mix以及 RNA提取、反转录试剂盒 4.2.3 仪器准备 ：高速离心机、 微量分光光度计 、电泳仪、 PCR仪、凝胶成像系统 4.2.4 研磨芽样品的研钵清洗后用无水乙醇点燃去除 RNase。 4.2.5 用于 RNA提取及反转录的 2 ml离心管、 1.5 ml离心管、 200 μL PCR 管及蓝、 黄、 白枪头均用 0.1 % 的DEPC水溶液（ ddH 2O: DEPC=1000: 1 ）37 ° C处理过夜， 121 ° C蒸汽灭菌 20 min，50 ° C烘箱烘干。 鉴 定开始前准备好口罩、手套，以及样品数 ×4的离心管并编号。 4.3 RNA提取及反转录 4.3.1 将所取的 1 ~ 4个芽位的样品 分别在研钵中用液氮冷冻并迅速研磨混匀。每份样品称取 20 mg 置于离心管 内； 4.3.2 使用 RNA提取试剂盒并根据说明书步骤提取芽组织 RNA； 4.3.3 使用微量分光光度计测定提取 RNA浓度，且OD260/OD280 在2.0左右， OD260/OD230 在2.0 ~ 2.4之间；统一用 DEPC水稀释至 100 ng/μL ，用于反转录。 4.4.4 将5 μL稀释后的 RNA加入无 RNase的200 μL PCR 管中，使用反转录试剂盒并根据说明书反转 录合成 cDNA，合成后的 cDNA用ddH 2O稀释至 100 ng/μL ，用于 PCR扩增。 全国团体标准信息平台 T/JSHS 004-2022 3 4.4 cDNA质量检测 4.4.1 利用 PCR仪扩增引物肌动蛋白（ ACT，GenBank 登录号： EC969944 ）； 4.4